左右半結(jié)腸癌與Programmed Death-1 信號(hào)通路

夏金紅 顧晉

結(jié)腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病率和死亡率均排在惡性腫瘤的前三位［1-3］。在結(jié)腸癌治療領(lǐng)域，長(zhǎng)久以來(lái)就存在一個(gè)爭(zhēng)議，那就是“左右半之爭(zhēng)”，左、右半結(jié)腸是不是同一種器官？左、右半結(jié)腸癌是不是同一種腫瘤？這些問(wèn)題引起了廣大腸癌研究者的注意。其中研究者Bufill［4］于1990 年首次系統(tǒng)地從多個(gè)方面闡述了左、右半結(jié)腸癌的不同，并提出二者是不同疾病的概念，將結(jié)腸以脾曲為界分為左半結(jié)腸（left sided colon，LSC）包括脾曲、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸，也稱(chēng)為遠(yuǎn)端結(jié)腸；右半結(jié)腸（right sided colon，RSC）包括盲腸、升結(jié)腸、肝曲和橫結(jié)腸，也稱(chēng)為近端結(jié)腸，并將原發(fā)于左、右半結(jié)腸的惡性腫瘤分別稱(chēng)之為左半結(jié)腸癌（left sided colon cancer，LCC）與右半結(jié)腸癌（right sided colon cancer，RCC）［5］。

左、右半結(jié)腸癌在胚胎來(lái)源、解剖結(jié)構(gòu)、生理功能、分子特征、致癌機(jī)制、臨床特征、治療療效、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移模式、生存預(yù)后等方面均存在不同［6-7］，其中二者在預(yù)后和治療療效上的差異引起了我們的關(guān)注。有研究者收集17 461 例腸癌患者，并對(duì)其預(yù)后進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)右半結(jié)腸癌患者無(wú)論是總體生存率（OS，RCC 67% vs LCC 71%； P ＜0.01）還是無(wú)病生存率（DFS，RCC 73% vs LCC 74%；P ＜0.01）均差于左半結(jié)腸癌患者［8］。在治療療效上，有研究表明接受FOLFOX 方案治療的Ⅲ期結(jié)腸癌患者中，左半結(jié)腸癌比右半結(jié)腸癌有更好的DFS（HR=0.82，P ＜0.001）［9］。此外，多個(gè)臨床試驗(yàn)也證實(shí)結(jié)腸癌的原發(fā)部位是影響靶向治療療效的重要因素［10］，EGFR 單抗治療能明顯改善LCC 患者的無(wú)進(jìn)展生存期及總生存時(shí)間［11-12］。正是基于此點(diǎn)，2017 年NCCN 指南進(jìn)行了重要更新，僅對(duì)左半結(jié)腸癌的KRAS/NRAS 野生型患者推薦一線行化療聯(lián)合EGFR 單抗治療。

左、右半結(jié)腸癌在預(yù)后和治療療效上存在如此顯著的差異，尋找左、右半結(jié)腸癌的差異基因及相關(guān)信號(hào)通路，探索左、右半結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的分子機(jī)制就成為了我們的研究目的。

材料與方法

一、TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)

本研究使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌RNAseq數(shù)據(jù)，選擇術(shù)前未經(jīng)任何化療或免疫治療的結(jié)腸癌患者為研究對(duì)象。共269 例CRC 患者，其中右半結(jié)腸癌110 例，左半結(jié)腸癌159 例。該數(shù)據(jù)集具有患者的隨訪信息，腫瘤解剖位置等信息。

二、免疫組化病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）全身檢查無(wú)多原發(fā)癌證據(jù)。（2）術(shù)前行纖維結(jié)腸鏡確診為結(jié)腸腺癌。（3）于我院行結(jié)腸癌切除手術(shù)。（4）術(shù)前未行未經(jīng)任何化療或免疫治療。

病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有腫瘤病史者。 （2）患者合并自身免疫性疾病或正在應(yīng)用免疫相關(guān)藥物者。（3）手術(shù)未完整切除原發(fā)腫瘤。（4）家 族性息肉病惡變、遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC）。（5）有心、肺、腎等嚴(yán)重并發(fā)癥者。

本研究納入2003 年2 月至2016 年12 月間北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科收治的263 例結(jié)腸癌患者的臨床資料，其中男性141 例，女性122 例，男女比為1.13:1，年齡28～85歲，平均（59.65±0.82）歲。 見(jiàn)表1。

表1 263 例結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征

續(xù)表

隨訪：所有患者均接受術(shù)后隨訪，術(shù)后2 年內(nèi)每3 個(gè)月1 次，術(shù)后3～5 年每6 個(gè)月1 次。復(fù)查包括病史和體檢，B 超或腹部CT，胸部平片，血清CEA、CA19-9。每年復(fù)查一次纖維結(jié)腸鏡檢查。

三、患者資料和標(biāo)本的采集

從病案室和統(tǒng)計(jì)室收集病例的臨床病理學(xué)資料和隨訪資料，從病理科收集病例的存檔石蠟標(biāo)本及組織切片。本研究得到北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

四、數(shù)據(jù)分析

使用TCGA數(shù)據(jù)分析左右半結(jié)腸癌差異基因，并于REACTOME 信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.reactome.org/）進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因在PD1/PDL1 信號(hào)通路富集，并分析了PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結(jié)腸癌的表達(dá)情況。對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行了Kaplan-Meier 生存分析。

五、免疫組化

PD1/PDL1/PDL2 在結(jié)腸腫瘤組織中的蛋白表達(dá)采用免疫組化的方法進(jìn)行測(cè)量。組織芯片（TMA）在70 ℃干燥5 分鐘，經(jīng)過(guò)三次二甲苯脫蠟，每次15 分鐘，然后依次通過(guò)梯度酒精進(jìn)行水化，每次 5 分鐘，再經(jīng)過(guò)3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液去除組織內(nèi)的過(guò)氧化物，抗原修復(fù)采用pH6.0 的檸檬酸鹽溶液高壓15 分鐘，山羊血清室溫封閉40 分鐘，一抗PD1（LS-B540，LifeSpan BioSciences，USA），PDL1（ab58810，Abcam，USA），PDL2（HPA013411，Sigma，USA）分別按照推薦濃度在4 ℃過(guò)夜孵育，次日經(jīng)過(guò)二抗室溫孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精及二甲苯脫水等步驟。最終獲得的芯片使用Leica Microsystems（Aperio versa 200）進(jìn)行掃描，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行閱片。對(duì)PD-L1 和PD-L2，通過(guò)染色強(qiáng)度記錄檢測(cè)到的蛋白表達(dá)量，免疫反應(yīng)細(xì)胞的百分比評(píng)分為：無(wú)染色組織為0，弱或中度染色到強(qiáng)染色＜25%為 1 級(jí)、25%～50%的細(xì)胞有強(qiáng)染色為2 級(jí)，50%以上的細(xì)胞有強(qiáng)染色記錄為 3 級(jí)。對(duì)于PD1，我們計(jì)算10 個(gè)互不重疊視野中的 PD1 ＋細(xì)胞總數(shù)，再計(jì)算每平方毫米內(nèi)PD1 ＋細(xì)胞密度，以此作為PD1 蛋白表達(dá)量計(jì)量方法。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析都是采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc，Chicago，IL）和GraphPad Prism 7.0。Mann-Whitney test 和t test 用于檢驗(yàn)蛋白及基因在癌組織中的表達(dá)差異。總生存（OS）時(shí)間被定義為從手術(shù)之日到因任何原因死亡的時(shí)間，Log-rank test 用于Kaplan-Meier 生存分析。P ＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、左、右半結(jié)腸癌差異基因與PD1 信號(hào)通路的數(shù)據(jù)分析

尋找左、右半結(jié)腸癌差異基因時(shí)，我們將TCGA 數(shù)據(jù)分為左半結(jié)腸癌組和右半結(jié)腸癌組，以差異表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5 倍，P ＜0.01作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出2 529 個(gè)基因，這批基因進(jìn)行通路富集，根據(jù)P 值和FDR值排序，前10 條都與免疫系統(tǒng)相關(guān)，如PD1 信號(hào)通路，TCR 相關(guān)信號(hào)通路以及MHC 二類(lèi)分子信號(hào)通路，見(jiàn)圖1。因此我們認(rèn)為PD1 信號(hào)通路在左、右半結(jié)腸癌中差異顯著。PD1 信號(hào)通路中重要的基因主要有PDCD1，CD274，PDCD1L2，且這三個(gè)基因都屬于左、右半結(jié)腸癌差異基因。

二、PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結(jié)腸癌中表達(dá)差異的數(shù)據(jù)分析

首先我們利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC 的RNAseq 數(shù) 據(jù)，分 析PDCD1，CD274 及PDCD1L2 于RNA 水平上在左、右半腸癌中的表達(dá)差異，結(jié)果見(jiàn)圖2。由結(jié)果可看出，三個(gè)基因在右半結(jié)腸癌的表達(dá)都高于左半結(jié)腸癌（P ＜0.05）；分層分析結(jié)果顯示，盲腸和升結(jié)腸中表達(dá)量較高，脾曲和降結(jié)腸表達(dá)量較低。

圖1 2 529 個(gè)左、右半結(jié)腸癌差異基因reactome 通路分析

Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，這三個(gè)基因在整體結(jié)腸癌中的表達(dá)量與預(yù)后無(wú)關(guān)，但是我們將患者根據(jù)腫瘤位置以及基因表達(dá)量高低，分為右側(cè)高表達(dá)組，右側(cè)低表達(dá)組，左側(cè)高表達(dá)組，左側(cè)低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier 預(yù)后分析，分析左、右半位置和表達(dá)量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PDCD1，CD274，PDCD1L2 基因高表達(dá)時(shí)，RCC 預(yù)后顯著差于LCC（OS，P ＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結(jié)腸癌中的表達(dá)差異。2A：PDCD1，CD274，PDCD1L2 在RCC 中表達(dá)高于LCC；2B：PDCD1，CD274，PDCD1L2 在各亞部位腸癌的表達(dá)

圖3 PDCD1，CD274，PDCD1L2 在左、右半結(jié)腸癌中的生存分析。3A～3C：PDCD1，CD274，PDCD1L2在高表達(dá)時(shí)，才有RCC 預(yù)后差于LCC；3D：在整體CRC 患者中，RCC 預(yù)后差于LCC

三、PD1，PDL1 和PDL2 在左右半結(jié)腸癌中的蛋白表達(dá)差異

為了明確PD1，PDL1 和PDL2 在組織中的分布情況以及在左、右半結(jié)腸癌中的蛋白表達(dá)差異，我們收集263 例結(jié)腸癌患者臨床樣本進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示PD1 主要表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，PDL1 和PDL2 主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。蛋白表達(dá)與RNA 表達(dá)結(jié)果基本一致，PD1，PDL1 在右半中表達(dá)量高于左側(cè)（P ＜0.05），而PDL2在二者中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054）。 Kaplan-Meier 生存分析顯示（圖5），只有PDL1的表達(dá)量影響患者的預(yù)后，即PDL1 的表達(dá)量越高預(yù)后越差（OS，P=0.0168），且在分層分析中右側(cè)PDL1 高表達(dá)組預(yù)后最差，而PD1 與PDL2 的表達(dá)量不影響患者的預(yù)后（OS，P ＞0.05）。

討 論

圖4 PD1，PDL1 在左、右半腸癌中的免疫組化結(jié) 果。4A：PD1 在左右半結(jié)腸癌中的表達(dá)免疫組化結(jié)果，在RCC 中的表達(dá)高于LCC，P=0.007；4B：PDL1 在左右半結(jié)腸癌中的表達(dá)免疫組化結(jié)果，在RCC 中的表達(dá)高于LCC，P=0.0044

圖5 PDL2 在左、右半結(jié)腸癌中的免疫組化結(jié)果及Kaplan-Meier 生存分析。5A：PDL2 在左、右半結(jié)腸癌中的免疫組化結(jié)果，P=0.054；5B：根據(jù)免疫組化結(jié)果，PD1，PDL1，PDL2 的Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果

左、右半結(jié)腸癌在解剖病理、治療和預(yù)后方面的差異成為結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，本文的分析也證實(shí)右半結(jié)腸癌的預(yù)后差于左半結(jié)腸癌。越來(lái)越多的研究者通過(guò)組學(xué)分析的手段發(fā)現(xiàn)了左、右半結(jié)腸癌之間存在不同的分子學(xué)特征［13］，更加證實(shí)了RCC 和LCC 是兩種不同疾病的定論，但是RCC 預(yù)后更差的機(jī)制仍沒(méi)有得到確切的定論。

本研究通過(guò)分析左、右半結(jié)腸癌差異基因和通路，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集于免疫相關(guān)通路，說(shuō)明左、右半結(jié)腸癌的免疫狀態(tài)顯著不同。免疫狀態(tài)不一樣影響結(jié)腸癌的預(yù)后和療效，免疫功能活躍的腫瘤患者預(yù)后較好且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低［14］，免疫狀態(tài)差的腸癌患者對(duì)治療的反應(yīng)率也比較低［15］，這提示左、右半結(jié)腸癌在預(yù)后及治療療效上的差異可能是由于免疫狀態(tài)差異導(dǎo)致的。

我們發(fā)現(xiàn)左、右半結(jié)腸癌預(yù)后差異與PD1 信號(hào)通路顯著相關(guān)，且該通路中三個(gè)主要基因（PDCD1， CD274 和PDCD1L2）在mRNA 水平上，RCC 中的表達(dá)都高于LCC。根據(jù)腫瘤解剖學(xué)位置分層分析， 盲腸和升結(jié)腸中表達(dá)量較高，脾曲和降結(jié)腸表達(dá)量較低。生存分析提示，這三個(gè)基因在CRC 整體中的表達(dá)量與CRC 總體預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)，但是我們根據(jù)腫瘤位置和基因表達(dá)量將患者分為右側(cè)高表達(dá)組，右側(cè)低表達(dá)組，左側(cè)高表達(dá)組和左側(cè)低表達(dá)組再分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PDCD1，CD274，PDCD1L2 基因高表達(dá)時(shí)，RCC 預(yù)后均差于LCC 的趨勢(shì)才會(huì)出現(xiàn)。

我們通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察PD1，PDL1 和PDL2 在左、右半結(jié)腸癌中蛋白水平的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。Kaplan-Meier 生存分析顯示，只有PDL1的表達(dá)量影響患者的預(yù)后，即PDL1 的表達(dá)量越高預(yù)后越差，而PD1 與PDL2 的表達(dá)量不影響患者的預(yù)后［16］。

在腫瘤微環(huán)境中，表達(dá)PD1 的T 細(xì)胞可與表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的PDL1/PDL2 結(jié)合，從而抑制T 細(xì)胞的免疫功能。PD1（PDCD1，CD279）是一種跨膜蛋白受體，主要表達(dá)于T 細(xì)胞，B 細(xì)胞，單核細(xì)胞，自然殺傷性T 細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞膜上［17］。PDL1（CD274） 和PDL2（PDCD1L2，CD273）是PD1 的下游信號(hào)通路受體，同樣也是跨膜蛋白，PDL1 表達(dá)于多種細(xì)胞表面，其中在多種腫瘤細(xì)胞（乳腺癌，卵巢癌，結(jié)直腸癌等）上高表達(dá)，而PDL2 表達(dá)量較低，多表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和某些特定的B 細(xì)胞亞群等［18］。在腫瘤中，PD1/PDL1 信號(hào)通路能夠抑制T 淋巴細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子的釋放，引起腫瘤相關(guān)性T 細(xì)胞的耗竭和凋亡，進(jìn)而使得腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻 擊［19-20］。因此本研究提示，右半結(jié)腸癌預(yù)后差可能與PD1 信號(hào)通路在RCC 中激活有關(guān)。

目前PD1/PDL1 抗體治療用于多種晚期腫瘤的治療，且取得了明顯的效果［12］。但是對(duì)于晚期結(jié)腸癌患者，使用PD1/PDL1 抗體治療僅有少數(shù)患者取得明顯的療效［21］。本研究顯示左、右半結(jié)腸癌免疫狀態(tài)不同，PD1信號(hào)通路的活化狀態(tài)也不相同，可能影響左、右半結(jié)腸癌患者的預(yù)后及治療療效。因此對(duì)結(jié)腸癌以及PD1/PDL1 信號(hào)通路兩者之間的關(guān)系進(jìn)行更細(xì)致的研究，有助于探索左、右半結(jié)腸癌差異及其與預(yù)后相關(guān)的機(jī)制，為患者治療前的選擇提供更好的指導(dǎo)。