3種新型魚源真菌的分離鑒定與孔雀石綠替代藥物篩選

彭開松 魯子怡 董昭然 樊慧敏 唐慶權(quán) 許曉牧 鮑傳和 朱若林 熊大華

摘要?[目的]從患病魚類體內(nèi)和體表分離鑒定出新型魚源真菌，并用于抗真菌藥物的體外藥效評(píng)價(jià)。[方法]通過選擇性固體培養(yǎng)基分離純化魚源真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和真菌ITS序列分子鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定10種漁用抗真菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）。[結(jié)果]黑魚體表分離的真菌ZJLD001株為煙管菌（Bjerkandera adusta），鯽體表分離的真菌ZJLD002株為白囊耙齒菌（Irpex lacteus），虹鱒內(nèi)臟分離的真菌ZJLD003株和ZJLD004株均為毛栓菌（Trametes hirsuta）。 水霉一潑凈、優(yōu)力克、菌霉凈、美凈推薦的使用劑量大于或等于測定的MIC;海富水霉靈、水霉菌毒凈、美婷、亞甲基藍(lán)、孔雀石綠和甲霜靈的推薦劑量低于測定的MIC值。[結(jié)論]該研究首次分離到3種新型魚源真菌;具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合功能的優(yōu)力克和美凈等新型殼寡糖類抗真菌劑的性價(jià)比和安全性最高，可以替代孔雀石綠用于魚類真菌病防治。

關(guān)鍵詞?魚源真菌;ITS序列;藥敏試驗(yàn);優(yōu)力克;美凈

中圖分類號(hào)?S?941.43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0115-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and Identification of Three New Fish?derived Fungi and Alternative Drugs Screening of Malachite Green

PENG Kai?song， LU Zi?yi， DONG Zhao?ran et al

（Laboratory of Aquatic Health and Public Health， College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui230036）

Abstract?[Objective]To isolate and identify new fish?derived fungi from the body and surface of diseased fish， and evaluate the efficacy of antifungal drugs in vitro. [Method] The fish?derived fungi were isolated and purified by selective solid medium. The morphological and fungal ITS sequence molecular identification was used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC）of 10 kinds of fish anti?fungal drugs by micro?broth dilution method. [Result]The fungus ZJLD001 strain from the surface of snakehead fish was Bjerkandera adusta，the fungus ZJLD002 strain isolated from the surface of crucian carp was Irpex lacteus， the visceral fungus ZJLD003 strain and ZJLD004 strain isolated from the internal organs of rainbow trout were Trametes hirsuta. The recommended doses of Shuimeiyipojing， Youlike， Junmeijing and Meijing were greater than or equal to the measured MIC value. The recommended doses of Haifushuimeiling， Shuimeijundujing， Meiting， methylene blue， malachite green and metalaxyl were far below the measured MIC values. [Conclusion] Three new species of fish?derived fungi were isolated for the first time in this study. New chitosan?oligosaccharide antifungal agents， such as Youlike and Meijing， which can promote wound healing， have the highest cost?effectiveness and safety， which can be used as alternative drugs to malachite green in the prevention and treatment of fish mycosis.

Key words?Fish?derived fungi;ITS sequence;Drug sensitivity test;Youlike;Meijing

水霉病是魚類最常見的外寄生真菌性疾病，其病原是多種水霉屬（Saprolegnia）和綿霉屬（Achlya）的成員[1]。水霉病的防控仍然是水產(chǎn)養(yǎng)殖的一大難題?？兹甘G曾經(jīng)是治療水霉病最有效的藥物，但因其致癌作用被我國列為禁用漁藥。目前，養(yǎng)殖戶一旦發(fā)現(xiàn)魚類患水霉病，就盲目使用各種殺水霉藥物。由于臨床上缺乏對(duì)水霉治療藥物的客觀評(píng)價(jià)，更加劇了臨床用藥的混亂。因此，篩選安全、有效的抗真菌藥物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。

筆者從體表長白毛的鯽、黑魚和虹鱒上分離、純化、鑒定出3種真菌，并采用體外試驗(yàn)分析了市場上常見抗真菌藥物對(duì)這3種真菌的藥效，以期為魚源真菌感染的防控提供借鑒。

1?材料與方法

1.1?病料

黑魚和鯽取自安徽省懷遠(yuǎn)縣，虹鱒取自青海省龍羊峽。患魚皮膚潰爛處長出白毛。

1.2?真菌的分離與純化

將黑魚或鯽體表的白色菌絲或虹鱒內(nèi)臟（肝、脾、腎）長有菌絲的部位，移至含氯霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，25 ℃下培養(yǎng)直至菌絲長出。多次純化菌落，直至無雜菌生長。最后，對(duì)純化菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3?真菌的分子鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）分別純化各株純化真菌的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板[2]。以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物，擴(kuò)增核糖體RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）[3]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）如下：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，2×ES Taq PCR Master Mix 10 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳純化鑒定目的片段，并將其回收后送交上海生工測序。將測序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)和使用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析后，提交NCBI網(wǎng)站獲得登錄號(hào)。

1.4?抗真菌藥物對(duì)分離株的最小抑菌濃度（MIC）

海富水霉靈（廣東海富藥業(yè)有限公司）;水霉一潑凈（山西昌泰動(dòng)物藥業(yè)有限公司）;水霉菌毒凈（烏魯木齊吉發(fā)漁藥有限公司）;優(yōu)力克（嘉興綠望生物科技有限公司）;菌霉凈（武漢華揚(yáng)天樂動(dòng)物保健品有限公司）;美凈（嘉興綠望生物科技有限公司）;復(fù)方甲霜靈粉（美婷，由上海海洋大學(xué)研制）;亞甲基藍(lán)、孔雀石綠和甲霜靈由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水生健康與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室提供。除甲霜靈用無水乙醇助溶后用蒸餾水溶解外，其他藥物均用蒸餾水溶解，過濾除菌后4 ℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

參考李愛華等[4]的方法，用0.85%無菌生理鹽水將真菌孢子濃度調(diào)整至OD560值為0.08～0.13（相當(dāng)于1×106～5×106 CFU/mL），使用前用RPMI-1640（含2%葡萄糖）進(jìn)行50倍稀釋。參考WS/T 411—2013方法用微量肉湯稀釋法測定常見10種藥物對(duì)分離株的敏感性[5]。

2?結(jié)果與分析

2.1?魚源真菌的分離

從黑魚體表白毛分離到ZJLD001株，3～5 d菌落長滿平板，呈均一白色棉絮狀，菌絲干燥、長約0.5～1.0 cm;從鯽體表白毛分離到ZJLD002株，5～7 d菌落長滿平板，菌絲呈輻射狀、比較均一、米白色、干燥;從虹鱒肝脾和腎臟分別分離到ZJLD003和ZJLD004株，7～10 d才可生長成型，菌落正中心生長出直徑1.0～1.5 cm、厚度0.8～10 cm的白色菌苔，菌落外周有少許干燥菌絲（圖1）。

2.2?分離菌的分子生物學(xué)鑒定

4株真菌的rRNA-ITS區(qū)基因擴(kuò)增得到500～750 bp的目的片段（圖2）。序列Blast比對(duì)和進(jìn)化分析表明，ZJLD001株（GenBank登錄號(hào)為MK829590）與煙管菌（Bjerkandera adusta）參考株（GenBank登錄號(hào)為AB733157.1）同源性達(dá)99.5%，置信度為93%;ZJLD002株（GenBank登錄號(hào)為MK829156）鑒定為白囊耙齒菌（Irpex lacteus）參考株（登錄號(hào)為MF101391.1）同源性達(dá)99.8%，置信度為95%;ZJLD003株（GenBank登錄號(hào)為MK830073）和ZJLD004株（GenBank登錄號(hào)為MK830074）鑒定為毛栓菌（Trametes hirsuta）參考株（登錄號(hào)為FJ537088.1）同源性達(dá)100%，置信度為100%（圖3）。

除水霉一潑凈、優(yōu)力克、菌霉凈、美凈的推薦使用劑量大于或等于測定的MIC值外，海富水霉靈、水霉菌毒凈、美婷、亞甲基藍(lán)、孔雀石綠和甲霜靈的推薦劑量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于測定的MIC值（表1）。

3?結(jié)論與討論

分離株的菌落形態(tài)分別與前人報(bào)道的煙管菌（Bjerkandera adusta）[6]、白囊耙齒菌（Irpex lacteus）[7]和毛栓菌（Trametes hirsuta）[8]相似。采用ITS序列對(duì)分離株的分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可相互應(yīng)證。黑魚中分離出的煙管菌（Bjerkandera adusta）屬于煙管菌屬，鯽魚中分離出的白囊耙齒菌（Irpex lacteus）屬于耙齒菌屬，虹鱒肝脾和脾臟分離出的毛栓菌（Trametes hirsuta）屬于栓菌屬。該研究中分離的4株菌均屬于擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科，且均可分泌漆酶，能降解木材中的纖維素、木質(zhì)素和半纖維素[8]，其中煙管菌還可以降解孔雀石綠[9]，毛栓菌（Trametes hirsuta）還可以降解有機(jī)磷農(nóng)藥[10]。

該研究首次從魚類分離到的3種新型真菌，但并不是漁源常見致病真菌。連續(xù)進(jìn)行了3次穿刺注射攻毒試驗(yàn)，每次每個(gè)分離株的每個(gè)劑量組均注射5尾泥鰍，結(jié)果顯示白囊耙齒菌（Irpex lacteus）組和毛栓菌（Trametes hirsuta）組未見死亡，煙管菌（Bjerkandera adusta）組泥鰍死亡1條。攻毒期間，泥鰍體表會(huì)出現(xiàn)小的腐皮現(xiàn)象和菌絲生長。這表明這4株真菌有弱致病性或無致病性。但這并不影響其可以用于評(píng)價(jià)漁用抗真菌藥的藥效。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，水霉一潑凈、優(yōu)力克、菌霉凈和美凈的抗真菌能力要優(yōu)于其他6種藥物，其中殼聚糖類新型漁用保健品（優(yōu)力克和美凈）使用濃度低且殺真菌效果好，還具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的功效，是具有開發(fā)前景的漁用抗真菌劑。

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