大鼠過(guò)勞模型心臟Cx43和Cx45的表達(dá)

楊博帆，史婧卓，李晶，潘玉蓬，肖寧，余彥耿，張付，王慧君，李冬日

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.廣東省公安廳 公安部法醫(yī)病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510050）

據(jù)2006年6月22日《環(huán)球時(shí)報(bào)》報(bào)道，中國(guó)每年有60萬(wàn)人死于過(guò)勞，居世界首位，過(guò)勞死已經(jīng)成為我國(guó)重大社會(huì)問(wèn)題[1]。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于過(guò)勞死的研究大多局限在社會(huì)學(xué)及法學(xué)領(lǐng)域，在病理學(xué)及病理生理學(xué)機(jī)制方面的研究較少，在法醫(yī)病理學(xué)診斷方面的研究更為欠缺[2]。根據(jù)傳統(tǒng)的過(guò)勞死概念，過(guò)勞可使?jié)撛诘募膊〖毙詯夯蝗凰劳?，根本死因還是潛在的自身疾病，屬于猝死范疇[3-4]。然而，本課題組在法醫(yī)病理學(xué)鑒定實(shí)踐中遇到多例無(wú)明顯自身疾病且與長(zhǎng)時(shí)間超負(fù)荷勞動(dòng)密切相關(guān)的急死案例，符合日本《關(guān)于腦血管疾病與虛血性心臟疾病（負(fù)傷引起的除外）的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)》的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，考慮過(guò)勞本身可能對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。

心臟的縫隙連接通道是心肌細(xì)胞間一種特殊的連接通道，縫隙連接通道的基本結(jié)構(gòu)單位是連接子，相鄰細(xì)胞通過(guò)各自的連接子對(duì)接形成一個(gè)完整的連接通道，每個(gè)連接子由6個(gè)跨膜蛋白分子即縫隙連接蛋白環(huán)形排列圍成[7]?？p隙連接通道的重要作用是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，主要表現(xiàn)為代謝偶聯(lián)和電偶聯(lián)，完成心肌細(xì)胞間的化學(xué)遞質(zhì)或電信號(hào)傳遞，是維持心肌細(xì)胞電生理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此縫隙連接蛋白在維持心臟節(jié)律方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。心臟內(nèi)的縫隙連接蛋白主要有連接蛋白（connexin，Cx）40、Cx43和Cx45等。Cx40主要分布于心房和近端傳導(dǎo)系統(tǒng)；Cx43主要存在于工作的心肌細(xì)胞內(nèi)；Cx45分布于整個(gè)傳導(dǎo)系統(tǒng)，是竇房結(jié)和房室結(jié)縫隙連接通道的主要蛋白[7]。近年來(lái)許多研究結(jié)果[10-19]均表明，Cx43和Cx45的含量與心臟功能相關(guān)，Cx43和Cx45的異常表達(dá)可能引起心臟功能的改變。

為探究過(guò)勞應(yīng)激是否對(duì)心臟功能產(chǎn)生直接影響，本研究建立大鼠過(guò)勞應(yīng)激模型，通過(guò)檢測(cè)左心室心肌細(xì)胞中Cx43和Cx45的表達(dá)情況，研究過(guò)勞應(yīng)激對(duì)心臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠9只，初始體質(zhì)量300～400g，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼料由該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每只大鼠分籠飼養(yǎng)，每天投放足量鼠糧和純凈飲用水，大鼠自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25℃、濕度50%，通風(fēng)流暢，無(wú)噪音。光照/黑暗周期為16h/8h，06：00開(kāi)燈，22：00關(guān)燈。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將9只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、過(guò)勞1月組和過(guò)勞2月組，每組3只。

1.2.2 大鼠過(guò)勞模型的建立

過(guò)勞組進(jìn)行強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)[20]。將過(guò)勞組所有大鼠每天同一時(shí)間放入水桶中游泳1h（16：00～17：00），水溫20～25℃，水深60cm，水桶直徑40cm。過(guò)勞1月組每只大鼠強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)持續(xù)1個(gè)月（30d），過(guò)勞2月組每只大鼠強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)持續(xù)2個(gè)月（60d）。每只實(shí)驗(yàn)大鼠游泳所用的水桶均相互獨(dú)立。判斷勞累的標(biāo)準(zhǔn)是在游泳過(guò)程中觀察到大鼠的鼻尖被水淹沒(méi)超過(guò)10s且連續(xù)發(fā)生3次及以上[20]。游泳結(jié)束后將大鼠放回籠中，自由活動(dòng)及飲食。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不予強(qiáng)制游泳。

1.2.3 取材

建模結(jié)束后，每只大鼠進(jìn)行稱(chēng)重。采用2%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后打開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，從心尖處刺入針頭用生理鹽水進(jìn)行灌注。采用輸液滴注方式進(jìn)行，灌注至大鼠體內(nèi)血液基本排出，血液排空的判定標(biāo)準(zhǔn)為大鼠肺部呈白色或眼球透明[21-22]。灌注完成后取下大鼠的心臟并稱(chēng)重。計(jì)算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，即心體比（‰）。切取心臟左心室心尖部，置于-80℃保存?zhèn)溆茫溆嗖糠种糜诙嗑奂兹┤芤褐泄潭ā?/p>

1.2.4 心肌細(xì)胞Cx43和Cx45的提取和檢測(cè)

將-80℃保存的左心室心尖部組織取出，液氮冷凍后轉(zhuǎn)移到研磨器中。按1 mL裂解液原液加20 μL蛋白酶抑制劑配制裂解液。按1 mg組織加10 μL裂解液的比例在研磨器中加入裂解液，研磨。研磨后將混合液置入微量離心管中，4℃下以14000×g離心10min。取上清液，按上清液與上樣緩沖液以4∶1的比例加入上樣緩沖液。振蕩，以2 200×g離心15 s，100℃水浴10min，取上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Western印跡法對(duì)Cx43和Cx45的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。上膠（濃縮膠）濃度為5%，下膠（分離膠）濃度為10%。上膠100 V固定電壓電泳0.5 h，下膠120 V固定電壓電泳2 h。200 mA固定電流2.5 h轉(zhuǎn)膜。采用含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）配置1∶20脫脂奶粉溶液，用于封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜。一抗（Cx43抗體、Cx45抗體和GAPDH抗體，1∶1 000，美國(guó)ABclonal公司）4℃孵育12 h。TBST洗滌條帶3次，每次5 min。二抗（山羊抗兔IgG抗體，1∶10 000，美國(guó)ABclonal公司）室溫孵育1 h。TBST洗滌條帶3次，每次5 min。曝光。用ImageJ軟件（美國(guó)National Institute of Mental Health公司）對(duì)曝光條帶結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 組織病理學(xué)染色方法

取出多聚甲醛溶液固定的心臟，切取左心室壁，沖洗多聚甲醛固定液，乙醇脫水，石蠟包埋。將石蠟組織塊以2 μm厚度連續(xù)切片并置于載玻片上，37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，然后65℃保持2h，石蠟切片用水脫蠟。

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色：將切片置于蘇木精溶液中數(shù)分鐘，酸水及氨水分色各數(shù)秒，流水沖洗1 h后入蒸餾水?dāng)?shù)秒，70%～90%乙醇溶液由低到高濃度依次脫水各10 min，再入乙醇伊紅染色液染色2～3min，無(wú)水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明。

Masson染色：Masson染色是用來(lái)顯示組織中纖維的一種染色方法，在鏡下觀察心肌纖維呈紅色，間質(zhì)纖維呈藍(lán)色。將切片放入Regaud氏蘇木精染液中5～10 min，流水充分沖洗后蒸餾水沖洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液復(fù)染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，再直接苯胺藍(lán)液染5min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，無(wú)水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明。最后，切片用中性橡膠包裹覆蓋。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件（美國(guó)IBM公司），采用t檢驗(yàn)分別將各過(guò)勞組與對(duì)照組大鼠的心體比（‰）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)，根據(jù)灰度值分析結(jié)果，將同一樣本Cx43和Cx45的灰度值分別與其內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的灰度值相比，根據(jù)該比值同樣采用t檢驗(yàn)對(duì)Cx43和Cx45的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)兩個(gè)過(guò)勞組大鼠間按相同分析方法對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 心體比結(jié)果

3組大鼠的心體比結(jié)果（表1）表明，與對(duì)照組相比，2個(gè)過(guò)勞組大鼠心體比增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過(guò)勞1月組大鼠的心體比與過(guò)勞2月組大鼠的心體比之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組大鼠的心體比結(jié)果 （n=3，±s，‰）

表1 3組大鼠的心體比結(jié)果 （n=3，±s，‰）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照過(guò)勞1月過(guò)勞2月大鼠心體比3.16±0.15 3.67±0.141）3.73±0.101）

2.2 Cx43和Cx45的表達(dá)

用Western印跡法對(duì)各組大鼠左心室心尖心肌細(xì)胞Cx43和Cx45的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，過(guò)勞組Cx43表達(dá)減少、Cx45表達(dá)增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；過(guò)勞2月組的Cx43表達(dá)減少與Cx45表達(dá)增加，與過(guò)勞1月組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 3組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達(dá)情況

表2 3組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達(dá)情況（n=3，±s）

表2 3組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43和Cx45的表達(dá)情況（n=3，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照過(guò)勞1月過(guò)勞2月Cx43 0.62±0.11 0.40±0.041）0.31±0.061）2）Cx45 0.45±0.14 0.74±0.121）0.92±0.081）2）

2.3 組織病理學(xué)染色結(jié)果

2.3.1 HE染色結(jié)果

對(duì)照組與過(guò)勞組大鼠左心室壁組織的HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，部分小血管周?chē)鷻z見(jiàn)少量纖維組織。與對(duì)照組相比，過(guò)勞組的心肌細(xì)胞排列較紊亂，心肌肥大，嗜酸性增強(qiáng)，部分心肌纖維斷裂，提示可能出現(xiàn)心肌細(xì)胞受損和間質(zhì)纖維增生。

2.3.2 Masson染色結(jié)果

對(duì)照組與過(guò)勞組大鼠左心室壁組織的Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)照組部分小血管周?chē)鷻z見(jiàn)少量纖維組織。與對(duì)照組相比，過(guò)勞組心肌間質(zhì)纖維明顯增生（圖3）。

圖2 對(duì)照組與過(guò)勞組大鼠左心室壁組織的HE染色結(jié)果（×100）

圖3 對(duì)照組與過(guò)勞組大鼠左心室壁組織的Masson染色結(jié)果（×100）

3 討 論

“過(guò)勞死”（Karoshi，death from overwork）一詞起源于日本，最早出現(xiàn)于二十世紀(jì)六七十年代日本經(jīng)濟(jì)繁榮時(shí)期[23]。日本圣德大學(xué)教授上畑鐵之丞首先提出過(guò)勞死的概念，他在《過(guò)勞死》一書(shū)中提出，過(guò)勞死不完全是醫(yī)學(xué)或統(tǒng)計(jì)學(xué)上的概念，而是工作積累所致，是以過(guò)重勞累為誘因，使高血壓和動(dòng)脈硬化等疾病惡化，引起心腦血管疾病急性發(fā)作，最后造成永久不能工作甚至死亡的狀態(tài)，屬于社會(huì)醫(yī)學(xué)范疇[24]。目前，日本厚生勞動(dòng)省對(duì)過(guò)勞死的定義為：由于超負(fù)荷勞動(dòng)，原有的高血壓、動(dòng)脈硬化等自身疾病進(jìn)一步惡化，誘發(fā)心腦血管疾病發(fā)作而導(dǎo)致死亡的狀態(tài)[25]。根據(jù)上述概念，患有高血壓、冠心病等自身疾病是先決條件，而過(guò)度勞累只是誘發(fā)因素。日本厚生勞動(dòng)省在《勞動(dòng)法》的基礎(chǔ)上，于2001年頒布了《關(guān)于腦血管疾病與虛血性心臟疾?。ㄘ?fù)傷引起的除外）的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)》，并于2015年進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了補(bǔ)充和修改。該項(xiàng)規(guī)定也體現(xiàn)了過(guò)勞對(duì)心腦血管疾病的誘發(fā)或加重作用。然而越來(lái)越多的研究結(jié)果[26-30]顯示，過(guò)勞本身可能就是引起人體各種疾病的直接原因，如高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥、抑郁癥等，過(guò)勞死的年輕化趨勢(shì)也是一個(gè)佐證[2]，而我們?cè)诜ㄡt(yī)病理學(xué)實(shí)踐中也遇到了一些沒(méi)有明顯基礎(chǔ)疾病但與過(guò)勞密切相關(guān)的急死案例[5-6]，其共同特點(diǎn)是心臟肥大和心肌間質(zhì)纖維化。

根據(jù)本研究結(jié)果，過(guò)勞大鼠的心體比明顯大于對(duì)照組，提示過(guò)勞應(yīng)激可能會(huì)使心臟質(zhì)量增加。而心臟質(zhì)量的增加可能與心肌肥大或纖維結(jié)締組織增生有關(guān)[31]，根據(jù)HE染色和Masson染色結(jié)果，與對(duì)照組相比，過(guò)勞組大鼠心肌肥大、心肌細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)，心肌間質(zhì)纖維明顯增生，提示過(guò)勞應(yīng)激使心肌損傷、心肌間質(zhì)纖維化，如果過(guò)勞應(yīng)激進(jìn)一步蓄積，不排除最終導(dǎo)致心力衰竭或心律失常而死亡的可能[32]。過(guò)勞大鼠與對(duì)照組大鼠左心室壁心肌細(xì)胞Cx43和Cx45的Western印跡法結(jié)果顯示，過(guò)勞可使大鼠左心室心尖部心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43表達(dá)降低、Cx45表達(dá)升高，且過(guò)勞時(shí)間越長(zhǎng)，Cx43表達(dá)降低或Cx45表達(dá)升高越明顯。近年來(lái)許多研究均證實(shí)，縫隙連接通道數(shù)目的減少或分布紊亂，將導(dǎo)致心臟的傳導(dǎo)異常，從而導(dǎo)致心律失常。Cx43的缺乏會(huì)更容易發(fā)生室性心律失常[10]，Cx43表達(dá)的降低與梗死后室性心律失常和心力衰竭的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[11-12]，在持續(xù)性心房顫動(dòng)的心肌細(xì)胞中Cx43的表達(dá)水平顯著下降[13]。與Cx43不同的是，Cx45在工作心肌細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低的水平[14]，但有研究結(jié)果[16-17]表明，Cx45在心力衰竭時(shí)表達(dá)會(huì)增加，并且Cx45表達(dá)的增加會(huì)提高患心律失常的可能性。因?yàn)镃x45可以和Cx43形成異源通道，Cx45與Cx43比值的增加可能減小縫隙連接的大小，也可能誘導(dǎo)病理狀態(tài)下的心律失常[15，18-19]，即當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43表達(dá)降低和Cx45表達(dá)升高時(shí)，將可能出現(xiàn)心律失常。本研究中Western印跡法結(jié)果提示，隨著過(guò)勞應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn)也將升高，可能也是心肌受損、心肌間質(zhì)發(fā)生纖維化及心臟質(zhì)量增加的原因。

本研究初步證實(shí)了過(guò)勞應(yīng)激可對(duì)心臟功能產(chǎn)生直接的影響，長(zhǎng)期過(guò)勞應(yīng)激的蓄積可能是導(dǎo)致死亡的根本原因。