基于DNA甲基化推斷年齡的研究進展

孟航 ，馬開軍 ，董利民 ，李成濤 ，肖碧 ，許路易 ，黃平 ，謝建輝

（1.上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；2.上海市公安局物證鑒定中心，上海 200083；3.復旦大學法醫(yī)學系，上海 200032；4.上海市公安局閔行分局，上海 201108；5.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063）

年齡推斷屬法醫(yī)人類學領域的范疇，是對個體年齡的刻畫，常用于輔助刑事案件的偵查、刑事責任能力的認定、災難事故中未知受害者年齡的判定等司法鑒定實務。此外，年齡推斷在人民生活的其他方面也有廣泛的應用，如社會福利的確認、體育運動員的選拔、體育比賽資格的核查、青少年入學和入伍等[1]。

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的迅速發(fā)展，法醫(yī)學年齡推斷的范疇已經(jīng)不僅限于刑事案件、災難事故中的受害者，更拓展至犯罪嫌疑人在現(xiàn)場所留下的生物檢材，如血液、唾液、精液以及其他人體體液等，都可以為法醫(yī)學者們所利用，以進行全面的“表觀遺傳學刻畫”，如年齡推斷、面貌刻畫（臉型[2-3]、頭發(fā)顏色[4-5]、虹膜顏色[5-6]、禿頭[7]）、皮膚顏色[8]、身高推斷[9]等。

目前運用分子生物學技術進行年齡推斷的方法主要包括DNA甲基化、端粒長度[10-14]、天冬氨酸外消旋[15-18]、線粒體中4977bp缺失[19-21]、T細胞受體刪除環(huán)（T-cell receptor excision circle，TREC）[22-26]、糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGES）[27-29]、mRNA[30]等。目前，基于DNA甲基化推斷年齡的研究被廣泛開展[31-32]。

DNA甲基化是表觀遺傳的一種變化形式，個體發(fā)育和衰老都受到表觀遺傳變化的影響[33-34]，而DNA甲基化是其中最重要的表現(xiàn)之一。DNA甲基化是哺乳動物細胞核苷酸的胞嘧啶中添加1個甲基（-CH3）至其5′碳（C5）上，主要發(fā)生在CpG位點，尤其是在CpG島。在人類基因組中基因的甲基化率占70%～80%[35]。

目前，DNA甲基化在法醫(yī)學中的應用主要體現(xiàn)在體液來源鑒定、年齡推斷和同卵雙胞胎鑒別等方面，其中對年齡推斷的研究較為深入。研究結果[36]表明，DNA甲基化與年齡變化密切相關，人類基因組甲基化水平隨著人年齡增高而不斷降低。

1967年，BERDYSHEV等[37]最早研究DNA甲基化與衰老的關系。2013年，HORVATH等[38]提出了能體現(xiàn)人類衰老的“老化時鐘”（aging clock）概念，并建立353個年齡相關的CpG位點組成的多組織年齡預測模型，從而奠定了使用DNA甲基化進行年齡推斷的基礎。在此之后，關于研究DNA甲基化與衰老機制，以及篩選年齡相關的甲基化位點、年齡相關性DNA甲基化位點在不同組織間的差異等研究逐步開展起來。DNA甲基化隨年齡變化受多種因素影響，如生活方式[39]、吸煙[40]、酒精攝入量[41]、藥物濫用[42]、飲食[43]、性別[44-46]、體育鍛煉[47-48]，甚至生育史[49]等。此外，DNA甲基化隨年齡的改變還存在組織特異性差異，即不同類型的細胞中，甲基化模式各異。因此，基于DNA甲基化的年齡推斷研究具有相對獨立性，往往針對特定組織類型的生物檢材，如血液、唾液、精液或其他類型的體液。

1 進行年齡推斷的檢材

1.1 血液

血液及其形成的血痕，是犯罪現(xiàn)場最為常見的生物物證。血液也是基于DNA甲基化年齡推斷研究開展最早、研究最多、最為充分的生物檢材[44，49-59]。美國學者HANNUM等[44]于2013年在Cell雜志上發(fā)表了全基因組甲基化譜與人類衰老率的相關研究，他們利用全基因組甲基化測試芯片，從全血的450 000個CpG中篩選出年齡相關的甲基化位點71個并建立模型，模型相關性為96.3%，預測年齡誤差為3.88年。

近年來，有關DNA甲基化年齡推斷的研究不斷深入，目前研究方向已經(jīng)由全基因組甲基化水平測定，逐步發(fā)展到針對特定隨齡性甲基化CpG位點的甲基化程度的測定，后者更為簡便，DNA甲基化檢測成本更低，更利于在法醫(yī)學實踐中推廣和運用。

德國WEIDNER等[49]于2014年通過亞硫酸氫鹽焦磷酸測序技術分析了151個血液樣品的DNA甲基化程度，篩選出3個包含隨齡性甲基化CpG位點的基因（ITGA2B、ASPA和PDE4C），并且預測年齡與實際年齡平均絕對偏差（mean absolute deviation，MAD）小于5年。波蘭學者ZBIEC-PIEKARSKA等[50]于2015年收集303份血樣（2～75歲）的DNA甲基化數(shù)據(jù)（焦磷酸測序技術檢測），并對ELOVL2基因的7個CpG位點數(shù)據(jù)進行分析建模，MAD為5.03年。在隨后的另一項研究[51]中，研究人員分析了420例血液樣本，從41個CpG位點中選取5個與年齡最顯著相關的CpG位點（ELOVL2、C1orf132、TRIM59、KLF14、FHL2）；模型的標準誤（standard error，SE）為4.5年，而測試組的MAD僅3.9年。中國學者HUANG等[52]于2015年用焦磷酸測序方法篩選出ITGA2B_1、NPTX2_3和NPTX2_4共3個新的CpG位點，隨后建立多元線性年齡預測回歸模型，MAD為7.87年。中國學者XU等[53]于2015年選取11個年齡相關CpG建立了4種不同的模型（這些CpG分別位于ADAR、AQP11、ITGA2B、PDE4C基因），分別為多元線性回歸、多元非線性回歸、人工神經(jīng)網(wǎng)絡（artificial neural network，ANN）和支持向量回歸（support vector regression，SVR）模型，結果發(fā)現(xiàn)SVR最為穩(wěn)健。韓國學者PARK等[54]于2016年選取3個與年齡相關的CpG位點（位于ELOVL2、ZNF423和CCDC102B基因），后經(jīng)焦磷酸測序平臺對535例韓國人血液樣本進行甲基化測定并建模，結果顯示MAD為3.16年。西班牙學者FREIRE-ARADAS等[55]于2016年利用EpiTYPER技術，分析了ELOVL2、ASPA、PDE4C、FHL2、CCDC102B、C1orf132和chr16：85395429共7個與年齡相關的CpG位點，建立年齡推斷模型，MAD為3.07年。日本學者HAMANO等[56]于2016年運用甲基化敏感的高分辨率熔解（methylation sensitive-high resolution melting，MS-HRM）技術，對22份活體血樣和52份尸體血樣的甲基化狀態(tài)和實際年齡的非線性分布進行研究并建模預測年齡，結果顯示，74份樣本的訓練集MAD為7.44年，30份樣本的獨立測試集MAD為7.71年。英國學者MAWLOOD等[57]于2016年運用EpiTect Methyl II PCR系統(tǒng)（德國Qiagen公司）比較年齡相關基因的啟動子區(qū)域中CpG島的甲基化水平，確定了4個年齡相關基因（NPTX2、KCNQ1DN、GRIA2和TRIM58），并檢測了80例（18～91歲）女性血液DNA樣本的甲基化程度，結果顯示預測年齡與實際年齡之間絕對平均差異為7.2年。英國學者ALIFERI等[58]于2018年使用大規(guī)模平行測序（Illumina MiSeq）技術，對110例（11～93歲）全血樣品中的12個甲基化CpG位點進行定量分析并建模，結果發(fā)現(xiàn)52%的樣品預測誤差小于4年，86%不到7年。韓國學者JUNG等[59]于2018年研究了150例韓國人血液樣品中ELOVL2、FHL2、KLF14、C1orf132、MIR29B2C和TRIM59基因上5個CpG位點的DNA甲基化水平，并開發(fā)了多重甲基化SNaPshot測定法，該方法可以同時測量5個CpG位點DNA甲基化，所建模的MAD為3.48年。中國學者FENG等[60]于2018年收集390名中國北方漢族男性（15～75歲）的外周血樣品，使用EpiTYPER系統(tǒng)對這些CpG位點的甲基化水平進行了測定，建立的最優(yōu)模型MAD為2.89歲，經(jīng)比較分析表明，支持向量回歸、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等模型的性能并不明顯優(yōu)于線性模型。

1.2 唾液、精斑

在犯罪現(xiàn)場，除了最常見的血液檢材外，唾液和精斑等體液也經(jīng)常遇到，尤其是在涉及性犯罪的案件現(xiàn)場中。因此，如果對這些檢材進行年齡推斷，就可以引導偵查工作指向性犯罪的實施者，故具有非常重要的價值。

韓國學者HONG等[61]于2017年收集226例韓國人（18～65歲）的唾液樣本，并選取6個年齡相關的CpG（位于基因CNGA3、KLF14、TSSK6上）和1個唾液特異性CpG標記（來自PTPN7基因的cg18384097），應用多重甲基化SNaPshot技術進行測定，線性回歸模型的MAD為3.13年。日本學者HAMANO等[62]于2017年收集197例日本人的唾液樣本，選取ELOVL2為年齡預測標志物，使用MS-HRM技術進行甲基化測定，結果顯示197例建模樣本的MAD為5.96年。英國學者ALIFERI等[58]于2018年選取12個年齡相關甲基化CpG位點，使用大規(guī)模平行測序（Illumina MiSeq）的DNA甲基化定量測定技術分析了34個唾液樣本，建模后測試發(fā)現(xiàn)，50%的樣本誤差小于4年、70%的誤差小于7年。韓國學者JUNG等[59]于2018年研究了來自唾液和口腔拭子樣品中的5個CpG的DNA甲基化水平（這些CpG來自ELOVL2、FHL2、KLF14、C1orf132、MIR29B2C和TRIM59基因），建模測試后發(fā)現(xiàn)，MAD分別為3.55年（唾液）和4.29年（頰部棉簽涂取物）。韓國學者LEE等[63]于2018年選擇3個CpG（TTC7B基因中的cg06304190、NOX4基因中的cg12837410和cg06979108），開發(fā)了基于韓國人群精液中DNA甲基化模式的年齡預測模型，其MAD為4.8年。

2 主要的DNA甲基化檢測平臺及技術

DNA甲基化年齡推斷的研究隨著檢測手段、檢測平臺的發(fā)展而發(fā)展，從2013年開始，甲基化檢測從全基因組檢測到特定基因的CpG位點檢測，目前主要的研究平臺有焦磷酸測序[51]、EpiTyper[55，64]、HRM[65]、SNaPshot[59]、大規(guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS）[67]等。

選擇用于DNA甲基化檢測技術平臺時要考慮分析所需的DNA的量和質，方法的準確性、可靠性、簡便性以及檢測流程所需時間和費用等關鍵因素[68]。不同的平臺都有其優(yōu)缺點，如常用的EpiTYPER?質譜技術，是一種定量方法，可以實現(xiàn)對單CpG的檢測，并且通量高[69]，使用專用軟件工具，通過比較甲基化和非甲基化之間的質量信號強度來計算DNA甲基化水平。但是，該技術不能分開相同大小的分子，并且不太適合設備檢測質量窗口（相對分子質量1 000～7000）以外的那些分子[55]。

SNaPshot檢測法原本是為SNP分析而開發(fā)的一種方法，也可以用于對DNA甲基化的檢測，其原理是初始DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽轉化后，通過單核苷酸引物延伸來分析CpG位點的甲基化程度[70]。優(yōu)點是能利用現(xiàn)有生物物證實驗室的設備，而且該方法具有多通路、高靈敏的特點。缺點是對DNA甲基化測量的準確性不高，只能做到半定量，檢測周期長（2～3d），這些限制了該技術在實際案件中的應用。

MS-HRM可以得到該基因整體甲基化程度的近似平均值[71-72]。這種方法僅需實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）儀，且具有簡便、快速、成本低、有效防止污染的特點。日本學者HAMANO[56]使用此技術對血液樣本進行了研究，構建了年齡推斷模型。ANTUNES等[73]描述了MS-HRM在法醫(yī)學領域內的應用潛力。但是，這種方法也有很多缺點，如會產(chǎn)生PCR偏倚、結果不太精確、不能針對于特定的CpG位點進行檢測。這些缺點限制了這項技術在法醫(yī)學領域中的應用[56]。

自從2018年開始，應用MPS進行DNA甲基化的研究開始出現(xiàn)[66-67]。MPS具有高檢測通量的特點，但到目前為止，這種檢測手段尚未大規(guī)模應用，可能與成本高昂有關。另一方面，MPS的數(shù)據(jù)分析程序需要專業(yè)人員，檢測時間也較長。

焦磷酸測序技術可以對單個表觀遺傳基因座相關的CpG位點的甲基化程度進行定性和定量分析，并且對每個CpG位點甲基化程度測量精度都相對較高[73]。TOST等[74]報道了定量焦磷酸測序法，此法重復性好。在亞硫酸氫鹽處理和（或）PCR反應相同的情況下，甲基化結果的不同僅為5%。

與大多數(shù)DNA甲基化檢測技術需要大量DNA樣本相比較，焦磷酸測序可以用少至10 ng（前修飾）和2.5ng（修飾后）的DNA樣本量來進行檢測[50，75]。已有研究[76-77]表明，焦磷酸測序敏感性高（低至50～100 pg的DNA，大小取決于基因座），更為重要的是此方法適用于那些存在降解、受污染等有“瑕疵”的DNA樣本。因此，這種技術是目前評估DNA甲基化水平最可靠的方法，簡單、易用、成本相對較低、具有時間效率（焦磷酸測序只需要2～4h[66]），并且相對容易，適用于法醫(yī)學實驗室[54]。值得注意的是，焦磷酸測序將來有可能實現(xiàn)復合擴增檢測分型，以進一步簡化操作流程并降低技術分析的成本[78]。

3 DNA甲基化年齡推斷的建模方法

在構建DNA甲基化年齡推斷的模型方面，近年來法醫(yī)學研究者們嘗試了多元線性回歸、支持矢量的模型、基于最小二乘算法的模型、非線性回歸模型、基于ANN算法的模型等，并比較了不同模型的年齡推斷準確度[79-80]。應用最廣泛的是線性回歸建模，包括多元線性回歸模型[54]、單變量線性回歸模型[56，61]。此外，還有許多非線性建模的方法，如多元非線性回歸模型[53]、多元分位數(shù)回歸模型[55，64，79]、加權最小二乘回歸模型[79]、普通最小二乘回歸模型[79]、支持矢量回歸模型[53]、基于ANN算法模型[80]和基于隨機森林回歸算法模型[81]等。目前主要的模型種類及建模方法見表1。

表1 近年來DNA甲基化年齡推斷研究的建模方法

由表1可知，研究人員考慮了研究樣本統(tǒng)計建模方法。例如，在處理非常數(shù)、非正態(tài)分布的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)時，SVR模型的年齡推斷準確性似乎表現(xiàn)得更好[79]，支持矢量模型的誤差相對于線性回歸較小[53]。最近，有學者[81]報道，基于ANN算法的模型在年齡推斷方面優(yōu)于“標準”的多元線性回歸模型，其中的原因迄今為止尚不清楚。但是，近期對中國樣本的研究結果[60]顯示，基于SVR、ANN等模型的性能并不明顯優(yōu)于線性回歸模型。此外，基于焦磷酸測序平臺的研究大多數(shù)是采用線性回歸模型，而且推斷精度也較高[50-52，54]，原因可能是線性回歸模型可以最大程度地保留原始數(shù)據(jù)包含的統(tǒng)計學信息，尤其在對低樣本量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計建模的情況下。

4 DNA甲基化檢測的敏感性研究

在法醫(yī)學實踐中，現(xiàn)場提取的生物物證有時屬于微量物證，因此甲基化檢驗需要考慮各種檢測方法的靈敏性。

按照目前主要的DNA甲基化檢測方法，在進行DNA甲基化檢測之前，所提取的原始DNA都需要進行亞硫酸氫鹽轉化，其原理是用亞硫酸氫鈉（NaHSO3）對樣品DNA中的胞嘧啶殘基進行化學變性，使其中未甲基化胞嘧啶通過水解脫氨作用轉化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶卻保持不變。隨后，在PCR擴增期間，由于DNA聚合酶不能識別那些尿嘧啶，尿嘧啶被替換為胸腺嘧啶（T），這個過程相當于為每個非甲基化CpG位點創(chuàng)建一個C/T變異[82]。

雖然這個過程在90年代早期徹底改變了整個表觀遺傳學的研究，但直到今天在亞硫酸氫鹽轉化的過程中，DNA片段化和DNA丟失的問題仍沒有很好地解決[83]。因此，大多數(shù)試劑盒需要高水平的DNA量才能實現(xiàn)最佳轉化（通常200～500ng）[84]，而在法醫(yī)學實踐中并非總能滿足要求。近年來，雖然研究人員已經(jīng)努力改進這種方法，如提升經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的DNA質量[85]、提升亞硫酸氫鹽轉化效率[86]等，但仍不理想。

表2 近年來DNA甲基化年齡推斷的研究

隨著技術的不斷優(yōu)化，甲基化分析所需要的DNA初始量在不斷減少，表2列出了近年DNA甲基化年齡推斷研究的DNA初始需要量。據(jù)報道，在PCR階段使用低至10 ng的DNA已經(jīng)取得了很高的預測準確度[50，81]。有研究[56，87]報道，在相同的預測準確度下，有希望在結果階段使用20ng DNA。2018年，ALIFERI等[58]利用MPS研究DNA需要量（亞硫酸氫鹽轉化之前50、25、10和1ng），結果顯示，50ng的DNA效果最佳，定量誤差和高預測精度的DNA模板量在1～10ng。隨著技術發(fā)展，尤其大規(guī)模平行測序應用推廣后，DNA甲基化的檢測靈敏度將會進一步提升。

雖然目前主流的DNA甲基化分析技術仍局限于亞硫酸氫鹽轉換的方法，但最近有報道[67]，使用納米孔測序技術，可以不需要亞硫酸氫鹽轉化過程，直接檢測DNA甲基化。

此外，還有第三代PCR技術——液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[89-90]，最近在中國青少年人群中得到了成功應用[1]。這項技術的主要優(yōu)點是可以實現(xiàn)甲基化檢測的數(shù)字化，靈敏度和準確度均很高，對檢測低甲基化程度非常有效（＜5%），但目前也需要進行亞硫酸鹽轉化。

隨著DNA甲基化年齡推斷的研究，年齡推斷的精確度、靈敏度、可靠性越來越高，而所用時間、檢驗成本越來越低。在未來，這一技術將在法醫(yī)學實踐中得到廣泛應用。