小鼠慢性肝損傷周期性病變研究

孟 霞 李 夢 翟亞南 盧 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，北京 100069)

CCl4是經(jīng)典的實驗性肝損傷外源性化合物，低劑量反復(fù)刺激可誘導(dǎo)慢性肝損傷[1-2]。目前關(guān)于CCl4慢性肝損傷模型的機制研究很多[3-6]，但是對于成模后肝損傷變化規(guī)律的研究很少，是持續(xù)性損害加深還是階段性的損害與修復(fù)交替變化，對于CCl4慢性肝損傷模型的實際應(yīng)用至關(guān)重要，直接關(guān)系到相關(guān)機制研究和藥性評價的可靠性。通常情況下CCl4慢性肝損傷模型的研究多參考CCl4急性肝損傷模型的研究方法，慢性染毒一段時間后，當血清、組織學(xué)等發(fā)生病變時即確定造模成功，繼而研究相關(guān)機制及藥效評價[7]。但是這種方法忽略了慢性染毒本身的特點：一方面，CCl4慢性肝損傷模型注射的CCl4濃度、劑量小，造成的肝損傷程度小，病程長；另一方面，肝臟是人體最大的解毒器官，具有很強的自愈再生能力。因此，在慢性染毒造模的幾周內(nèi)，肝損傷所致的血清、病理學(xué)改變是持續(xù)性穩(wěn)定增長，還是出現(xiàn)時而病變嚴重時而自愈緩解式的波動性變化就顯得至關(guān)重要。如果肝損傷是波動性變化，那么CCl4慢性肝損傷模型所反映出的將是一個明顯的“損傷—修復(fù)”交替主導(dǎo)的復(fù)合模型，與CCl4急性肝損傷模型所反映的以損傷為主導(dǎo)的單一模型將有很大區(qū)別。在損傷期內(nèi)，病理變化以炎性細胞浸潤和肝細胞變性壞死為主，病理機制以損傷為主導(dǎo)，適合進行與炎性反應(yīng)、細胞損傷壞死有關(guān)機制研究；在修復(fù)期內(nèi)，病理變化以肝細胞再生為主，病理機制以細胞增殖再生為主導(dǎo)，適合進行與肝細胞增殖再生有關(guān)機制研究。這就導(dǎo)致在選用該模型進行研究肝臟損傷或者修復(fù)機制研究、藥物篩選過程中，必須選取相應(yīng)的病理變化主導(dǎo)期進行評價，才能確保實驗結(jié)論的真實有效性?；谝陨纤伎迹_展相關(guān)實驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠125只，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購于北京維通利華實驗動物科學(xué)技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部屏障環(huán)境 [SYXK(京)2015-0012] 飼養(yǎng)。所有實驗操作程序均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(批準號為AEEI-2015-020)。

1.2 實驗試劑

CCl4溶液購自北京現(xiàn)代東方精細化學(xué)品有限公司。Masson 染色試劑盒購自南京建成科技有限公司，20100318。

1.3 模型制備

正常BALB/c小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，腹腔注射0.5% CCl4溶液(0.75 mL CCl4原液加入149.25 mL花生油)，10 μL/g體質(zhì)量，1次/3天，持續(xù)10周。注射第2、4、6、8、10周后，隨機抽取小鼠，取血檢測血清ALT、AST，取肝臟固定后HE、Masson染色，觀察小鼠肝臟結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、纖維化程度。

1.4 樣本處理

注射第2、4、6、8、10周后，隨機抓取小鼠(n=25)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg體質(zhì)量)；麻醉后，眼眶靜脈叢采血法采血；采血后，離心取血清(3 000 g/min，10 min)；采血后，頸椎脫臼安樂死并摘取肝臟；剪取肝臟最大葉，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)方法脫水、透明、包埋后制成蠟塊并切片備用。

1.5 AST、ALT檢測

日立7180全自動血生化儀檢測AST、ALT血清濃度。

1.6 肝臟組織石蠟切片HE染色及Masson染色

將肝臟組織石蠟切片進行水化處理后，分別使用常規(guī)法進行HE染色處理及Masson染色試劑盒進行Masson染色處理，中性樹膠封片后使用Nikon數(shù)字顯微照相機拍攝照片。

1.7 肝纖維化程度評判

Masson染色半定量分析：Masson染色切片，50 μm倍光鏡下，使用Nikon數(shù)字顯微照相機進行吸光度(IOD)測量，每組隨機選取10個視野。

1.8 肝組織炎性細胞浸潤、壞死肝細胞(玻璃樣變)、正常肝細胞測定方法

HE染色半定量分析：HE染色切片，50 μm倍下光鏡拍照，使用ipp6.0圖像分析軟件進行分析。

1.8.1炎性細胞、正常肝細胞測定：炎性細胞與正常肝細胞細胞核在HE染色下均為深藍染，但二者細胞核大小差異較大，選取藍染區(qū)域后，限定選取區(qū)域像素為0～600可在點選藍染范圍內(nèi)篩選出炎性細胞；限定選取區(qū)域像素為800～3 000可在點選藍染范圍內(nèi)篩選出正常肝細胞，然后計算點選區(qū)域細胞核總像素。

1.8.2壞死肝細胞(玻璃樣變)測定：玻璃樣變?yōu)槊黠@深紅色均質(zhì)染色，點選深紅染色區(qū)域后，計算點選區(qū)域總像素。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST變化

注射CCl4溶液2周后，小鼠ALT、AST輕度升高，提示肝細胞輕度損傷；注射4周后ALT、AST升高極為顯著，提示肝細胞損傷嚴重；注射6周后ALT、AST基本恢復(fù)正常；注射8周后ALT、AST再次輕度升高，提示肝細胞輕度損傷；注射10周后ALT、AST再次極顯著性升高，提示肝細胞損傷嚴重,見圖1。

圖1 B/c小鼠血清ALT、AST濃度(IU/L)注:兩組間比較，**P<0.01Fig.1 B/c mouse serum levels of ALT and AST(IU/L)Note：compared with two groups，**P <0.01

2.2 病理學(xué)觀察

HE染色顯示在注射CCl4溶液0～10周的時間內(nèi)，小鼠肝細胞出現(xiàn)明顯周期性損害，分別依次出現(xiàn)肝細胞變性期、壞死期、緩解期、肝細胞變性期、壞死期。2周時，肝細胞損害以變性為主，表現(xiàn)為肝細胞不典型空泡樣變性和大量炎性細胞浸潤；4周時，肝細胞損害以壞死為主，表現(xiàn)為大量深紅色玻璃樣變性及炎性細胞浸潤減少；6周時，肝細胞損害明顯緩解，僅存少量玻璃樣變性及炎性細胞浸潤；8周時，肝細胞損害再次以變性為主，表現(xiàn)為肝細胞大量空泡樣變性和炎性細胞浸潤；10周時，肝細胞損害再次以壞死為主，表現(xiàn)為大量深紅色玻璃樣變性及炎性細胞浸潤減少,見圖2～5。

圖2 B/c小鼠肝組織HE染色注:(A、B、C、D、E為100 μm，a、b、c、d、e為50 μm)，A、a是2周，B、b是4周，C、c是6周，D、d是8周，E、e是10周)Fig.2 Histology of the B/c mouse liver tissues.HE staining.Note:(A,B,C,D,E：100 μm.a,b,c,d,e：50 μm).A,a：2 weeks.B,b:4 weeks.C,c：6weeks.D,d：8weeks.E,e:10 weeks

圖3 B/c小鼠肝臟肝細胞壞死注:兩組間比較，**P<0.01;箭頭指示為肝細胞玻璃樣變性Fig.3 B/c mouse hepatocyte necrosisNote：compared with two groups，**P<0.01；the arrow indicates hyaline degeneration of hepatocytes

圖4 B/c小鼠肝臟肝細胞注:兩組間比較，**P<0.01；箭頭指示為正常肝細胞Fig.4 B/c mouse hepatocyteNote：compared with two groups，**P <0.01；the arrow indicates normal hepatocytes

圖5 B/c小鼠肝臟炎性細胞浸潤注:兩組間比較，**P <0.01，＊P <0.05；箭頭指示為炎性細胞浸潤Fig.5 B/c mouse inflammatory cell infiltration of the liverNote：compared with two groups，**P <0.01，＊P <0.05；the arrow indicates inflammatory cell infiltration

Masson染色顯示在注射CCl4溶液0～10周的時間內(nèi)，小鼠肝組織內(nèi)膠原蛋白、纖維沉積隨肝細胞損害出現(xiàn)明顯周期性變化。2周時，當肝細胞損害以空泡變性為主時，損傷區(qū)域出現(xiàn)淡藍染膠原蛋白沉積；4周時，當肝細胞損害以壞死為主時，損傷區(qū)域淡藍染膠原蛋白沉積逐步積聚為深藍染條索狀膠原纖維沉積；6周時，當肝細胞損害明顯緩解時，深藍染條索狀膠原纖維逐漸向淡藍染膠原蛋白轉(zhuǎn)化；8周時，當肝細胞損害再次以脂肪變性為主但未發(fā)生壞死時，膠原纖維繼續(xù)向膠原蛋白弱化；10周時，當肝細胞損害再次以壞死為主時，膠原蛋白開始逐步向膠原纖維沉積強化,見圖6～7。

圖6 B/c小鼠肝組織Masson染色注：A、B、C、D、E為100 μm，a、b、c、d、e為50 μm，A、a是2周，B、b是4周，C、c是6周，D、d是8周，E、e是10周Fig.6 Histological changes of the B/c mouse liver tissues.Masson stainingNote：A,B,C,D,E：100 μm.a,b,c,d,e：50 μm.A,a：2 weeks.B,b:4 weeks.C,c：6weeks.D,d：8weeks.E,e:10 weeks

圖7 B/c小鼠肝臟Msson染色注:兩組間比較，*P<0.05Fig.7 Histological changes of the B/c mouse liver tissues.Masson stainingNote：compared with two groups，*P<0.05

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，在注射CCl4溶液0～10周的時間內(nèi)，小鼠肝細胞出現(xiàn)明顯周期性損害，分別依次出現(xiàn)變性期、壞死期、緩解期。變性期以肝細胞變性為主，伴隨大量炎性細胞浸潤，此時肝細胞雖然受損但未發(fā)生壞死，因此ALT、AST僅輕度升高；隨著肝細胞變性加重及炎性細胞作用，變性期過渡到壞死期，損傷的肝細胞出現(xiàn)大量壞死，表現(xiàn)為大量無結(jié)構(gòu)的紅色均染玻璃樣變性，ALT、AST急劇升高，肝細胞、炎性細胞浸潤明顯較少；當壞死的肝細胞殘余被逐步吞噬吸收，壞死期開始向緩解期過度，炎性細胞浸潤進一步減少，玻璃樣變體大量消失，新生肝細胞增多，ALT、AST基本恢復(fù)正常；之后繼續(xù)按照此順序發(fā)生周期性病變。本實驗共觀察到1.5個周期性損害變化。

由此可見，在持續(xù)低劑量染毒過程中，同一周期內(nèi)不同的表現(xiàn)期，CCl4慢性肝損傷的作用機制不同，變性期、壞死期以損傷機制為主導(dǎo)，緩解期以修復(fù)機制為主導(dǎo)，是一種近似“損傷—修復(fù)”交替出現(xiàn)的模型。在損傷機制主導(dǎo)期，反映出類似CCl4急性肝損傷模型的病理變化，是研究CCl4導(dǎo)致肝損傷諸多機制的最佳窗口期；而在修復(fù)機制主導(dǎo)期，則反映出CCl4急性肝損傷模型不具備或者不顯著的肝細胞再生表現(xiàn)，是研究肝損傷后機體諸多修復(fù)自愈機制的最佳窗口期。因此我們認為選擇不同的窗口期，對于評價抑制肝細胞損傷或者促進肝細胞再生兩大類藥物的療效至關(guān)重要。

肝纖維化是伴隨肝損傷出現(xiàn)的膠原纖維沉積，一般認為是不可逆的過程。但是Ebrahimkhani等人研究發(fā)現(xiàn)，該過程或許存在逆轉(zhuǎn)的可能，其逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵就是肝細胞再生，肝纖維化的形成，需要肝星狀細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，表達α-平滑肌動蛋白、合成細胞外基質(zhì)，而肝星狀細胞的轉(zhuǎn)變需要激活其表面的5-羥色胺2B受體(5-HT2B)，進而激活轉(zhuǎn)化生長因子b1(TGF-b1)信號通路而完成，然而TGF-b1是肝細胞增殖強有力的抑制劑，當選擇性拮抗5-HT2B時能夠有效抑制肝星狀細胞TGF-b1表達，明顯減少肝星狀細胞轉(zhuǎn)化，在降低急、慢性肝損傷模型小鼠肝纖維化程度的同時，大量促進肝細胞再生[8]。本實驗也發(fā)現(xiàn)類似趨勢：在變性期時，肝細胞損害以脂肪變性為主，此時肝細胞雖然受損但未發(fā)生壞死，細胞結(jié)構(gòu)大致完整，因此僅在變性肝細胞周圍沉積淡藍染膠原蛋白；隨著損傷加重，變性期過渡到壞死期，出現(xiàn)大量肝細胞壞死后形成的無細胞結(jié)構(gòu)的玻璃樣變體，因此該區(qū)域內(nèi)膠原蛋白逐步積聚為深藍染條索狀膠原纖維沉積；到緩解期時，壞死肝細胞極顯著減少，肝細胞大量增殖再生，不僅膠原蛋白的沉積數(shù)量顯著減少，形態(tài)也從條索樣積聚弱化為分泌樣表現(xiàn)。這是CCl4慢性肝損傷模型區(qū)別于CCl4急性肝損傷模型的又一表現(xiàn)，要利用好CCl4慢性肝損傷模型研究肝纖維化逆轉(zhuǎn)機制、評價抗纖維化藥物療效，明確其周期性損傷變化、選擇好優(yōu)勢窗口期勢必至關(guān)重要。

值得注意的是，與建立CCl4急性肝損傷模型不同，我部選用不同批次同一來源種群的B/c小鼠建立CCl4慢性肝損傷模型時，雖然“損傷—修復(fù)”這一典型肝損傷病理表現(xiàn)周期性交替出現(xiàn)，但是這一循環(huán)性病變出現(xiàn)的時間點以及強度(ALT、AST)卻存在差異[9]。國外研究也有過類似發(fā)現(xiàn)，同一來源近交系小鼠會因裝運、籠具、個體持續(xù)性差異導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)顯著差異[10]。我們推測這與CCl4慢性肝損傷模型的病理特點密切相關(guān)，正是由于在染毒過程中劑量小和肝臟自愈再生能力強兩大特點，導(dǎo)致成模過程出現(xiàn)“損傷—修復(fù)”機制交替主導(dǎo)的復(fù)雜過程，為個體原本微小差異的持續(xù)性進展提供了可能。而這種近交系個體間固有的微小差異在CCl4急性肝損傷模型造模中基本不會表現(xiàn)出顯著差異，因為在急毒實驗中，大劑量CCl4根本不會給肝臟自愈任何機會，展現(xiàn)出完全的壓制性肝損傷病理表現(xiàn)。因此，在應(yīng)用CCl4慢性肝損傷模型進行研究時，應(yīng)著眼于對“損傷—修復(fù)”的周期性病變規(guī)律的影響，而不是對肝損傷出現(xiàn)的時間及強度的干預(yù)。

綜上所述，CCl4慢性肝損傷模型的制備與研究源于CCl4急性肝損傷模型，其肝組織損傷變化與急性模型相近而又有區(qū)別，具有明顯的周期性損害變化，在損傷期內(nèi)，病理變化以炎性細胞浸潤和肝細胞變性壞死為主，病理機制以損傷為主導(dǎo)；在修復(fù)期內(nèi)，病理變化以肝細胞再生為主，病理機制以細胞增殖再生為主導(dǎo)，是一種近似“損傷—修復(fù)”交替出現(xiàn)的模型，“損傷期”適合進行與炎性反應(yīng)、細胞損傷壞死有關(guān)機制研究，“緩解期”適合進行與肝細胞增殖再生有關(guān)機制研究。因此在使用CCl4慢性肝損傷模型進行肝損傷或修復(fù)機制研究或藥效評價時，應(yīng)重視該模型周期性的病變規(guī)律與特點，有針對性地選擇相應(yīng)“窗口期”，從而得到更為客觀有效的實驗數(shù)據(jù)。