SLC1A2基因SNP位點與拉布拉多和金毛獵犬活躍度的相關(guān)性研究*

馬雪娜 白 靜 陳舒婷 雒 東 李雅嬋 周子娟 王福金 王愛國 王靖宇

(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，大連 116044)

導(dǎo)盲犬是應(yīng)用動物行為學(xué)原理進(jìn)行培訓(xùn)的、專門為視障人士提供向?qū)Х?wù)的工作犬[1]。導(dǎo)盲犬的篩選標(biāo)準(zhǔn)是考察犬是否具備高效學(xué)習(xí)能力，并有主動完成工作意愿的、性情穩(wěn)定的犬。其中，活躍度是考察犬的重要指標(biāo)之一?；钴S度適中的犬，對主人依戀程度低、穩(wěn)定性強，是培育導(dǎo)盲犬的重要條件之一[2-3]。由于行為測試的結(jié)果受眾多因素的影響，不能十分客觀地對犬進(jìn)行早期預(yù)測，因而如果能夠結(jié)合遺傳學(xué)分子標(biāo)記來判斷犬的活躍度，將大大提升導(dǎo)盲犬的培育效率。

SLC1A2基因編碼的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸中，可以及時清除細(xì)胞外空間的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，維持突觸中低水平的谷氨酸濃度，保證有效的神經(jīng)傳導(dǎo)[4-5]。此前，SLC1A2基因多用于人類疾病方面的研究，大多研究表明SLC1A2基因的異常與人類的中風(fēng)、創(chuàng)傷、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化和亨廷頓病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，該基因還與人類和貓的情感覺醒和侵略相關(guān)[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)SLC1A2基因的多態(tài)性與拉布拉多犬的活動水平相關(guān)[8]。因此，本實驗將采用Passive test(PT)測試[9]評價犬的活躍程度，同時檢測其SLC1A2的多態(tài)性，驗證SLC1A2多態(tài)性與活躍度之間的相關(guān)性，以期為導(dǎo)盲犬早期選育篩選有效的遺傳學(xué)分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：拉布拉多犬80只，金毛獵犬19只，犬只及相關(guān)信息均由中國導(dǎo)盲犬大連培訓(xùn)基地提供。

1.1.2主要試劑與儀器：真空采血管，購于江蘇康健醫(yī)療用品有限公司(許可證號：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許可證2001-0330號)；Blood Extraction Kit試劑盒，購于寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司。主要儀器包括PCR儀(美國Thermo公司)；電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；Gel DocTM EZ成像儀(Bio RAD公司)等。

1.2 基因型檢測方法

1.2.1基因組DNA的提?。簭娜爸o脈采血5 mL，置于含EDTA抗凝劑的真空采血管中。采用Blood Extraction Kit試劑盒提取血細(xì)胞中的基因組DNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2引物設(shè)計：基因SLC1A2的3個SNP位點為自行設(shè)計，具體步驟如下：在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)上比對出相應(yīng)的SNP位點，然后以SNP位點為中心選取DNA序列，應(yīng)用Primer 3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)進(jìn)行引物設(shè)計，并對設(shè)計的引物進(jìn)行PCR驗證和條件優(yōu)化?；虻腟NP位點信息及引物序列詳見表1。

表1 SLC1A2基因SNP位點引物序列Table 1 List of primers for the SNP of SLC1A2

1.2.3PCR檢測和測序分析：PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；PCR循環(huán)：94 ℃ 1 min，退火溫度1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；延伸72 ℃ 7 min。凝膠成像系統(tǒng)顯影。將顯影明顯的產(chǎn)物，委托寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。通過測序數(shù)據(jù)的分析，確認(rèn)SNPs位點在測試犬中的基因型。

1.3 活躍度評價方法

1.3.1場地設(shè)施及PT測試方法：行為學(xué)PT測試在長方形室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)無實驗外的其他任何雜物，立體圖及平面圖如圖1所示。測試步驟如下：實驗人員由M門進(jìn)入測試室，自然站立于點E。犬主人帶著犬由N門進(jìn)入測試室，鎖好門，站立于D點，與實驗人員相對。測試開始時，松開犬鏈，讓犬在室內(nèi)自由活動。測試期間，不允許主人和實驗人員發(fā)出任何聲音、做出任何動作、與犬不能有任何交流。3 min后主人從N門離開，留下犬和實驗人員在測試室內(nèi)。然后實驗人員坐在事先準(zhǔn)備好的圓凳上閱讀(E)，不能發(fā)出任何聲音、不能做出任何動作且不能與犬有任何交流。3 min后測試結(jié)束，實驗人員帶領(lǐng)犬從M門走出測試室(圖1)。

圖1 PT測試示意圖注：E點為實驗人員的所在位置；D點為犬與主人進(jìn)入測試場地的所在位置；圖中④-⑦為安裝在高處的高清攝像頭；M與N為實驗人員出入的門Fig.1 Schematic diagram of Passive TestNote:E,the location of researcher;D,the location of owner and dog;④-⑦,the installed cameras;M and N,the doors

PT測試結(jié)束后，根據(jù)犬在實驗中的行為表現(xiàn)，結(jié)合測試中的觀察要點及行為類型(表2)針對其行為表現(xiàn)包括靜止時間、探索時間、探索范圍、是否發(fā)出聲音等判斷活躍度高低，活躍程度越高得分越高，進(jìn)行1～5分的評價(表3)，評分人員為基地的訓(xùn)導(dǎo)員和有經(jīng)驗的實驗人員。主人在時和主人不在時分兩個階段進(jìn)行評分。

表2 測試中評分的行為類型Table 2 Behavior types in Passive Test

表3 被動測試各變量評分依據(jù)Table 3 Scoring criteria for each variable of Passive Test

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，利用ANOVA檢驗對SLC1A2基因SNPs位點多態(tài)性與各種性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，P<0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 SLC1A2基因3個SNP位點的多態(tài)性分析

為了明確SLC1A2基因3個SNP位點的基因型，我們將SLC1A2基因的3個SNP位點的PCR/測序結(jié)果通過BIOEDIT軟件進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)在所測試的導(dǎo)盲犬中c.129T>C(T129C)位點的基因型都是C/C型，c.1549T>G(T1549G)位點都是G/G型，這兩個位點在金毛獵犬和拉布拉多犬中均沒有多態(tài)性。因此，這兩個位點不再進(jìn)行后續(xù)的分析。而c.471T>C(T471C)位點基因型具有多態(tài)性，經(jīng)檢測有3個基因型，分別為T/C型、T/T型和C/C型(圖2)。

圖2 SLC1A2基因SNP位點(c.471C>T)的測序結(jié)果注:A.T/C型;B.T/T型;C.C/C型Fig.2 The sequencing results of SLC1A2 SNP loci (c.471C>T)Note:A:T/C,B:T/T,C:C/C

2.2 活躍度與品種、性別的相關(guān)性分析

為了觀察導(dǎo)盲犬的活躍度是否與品種、性別之間具有相關(guān)性，我們將測試犬只的品種、性別以及其活躍度評分進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，其結(jié)果如圖3所示：不同品種間，金毛獵犬活躍度的平均得分為(2.76±0.28)，拉布拉多犬活躍度的平均得分為(2.61±0.11)，兩者得分情況基本持平，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析活躍度與品種間沒有顯著性差異(P>0.05)；不同性別間，雄性犬只的活躍度得分為(2.83±0.14)，雌性犬只的活躍度得分為(2.41±0.15)，雄性犬只的活躍度明顯高于雌性犬只，據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示活躍度與性別間的差異較為顯著(P=0.049)。

圖3 活躍度與品種、性別的相關(guān)性分析Fig.3 Analysis of the correlation between activity level and breed or sex

2.3 基因型與品種、性別的相關(guān)性分析

為了明確導(dǎo)盲犬的品種、性別是否與T471C位點的3種基因型間具有相關(guān)性，我們對測試犬只的品種、性別以及其相對的基因型進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果如圖4所示：不同品種間，金毛獵犬和拉布拉多犬的基因型分布趨勢基本一致，均以T/T型居多，其次為T/C型，最少的是C/C型；不同性別間，雄性和雌性的基因型分布趨勢一致，也是以T/T型居多，其次為T/C型，最少的是C/C型。據(jù)統(tǒng)計分析，基因型與品種、性別之間沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 基因型與品種、性別的相關(guān)性分析Fig.4 Analysis of the correlation between genotype and breed or sex

2.4 基因型與活躍度的相關(guān)性分析

為了明確導(dǎo)盲犬的活躍度是否與T471C位點的多態(tài)性相關(guān)，我們對所測試的犬只的基因型和其活躍度進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，其結(jié)果如圖5所示：在不同的評分區(qū)間，T/T型，T/C型和C/C型這3種基因型的分布趨勢基本一致。即在各評分區(qū)間，T/T型的犬只數(shù)量最多，其次為T/C型。而對于C/C型的犬只，活躍度都集中在2～4分。對于不同基因型的犬，其所對應(yīng)的活躍度的平均得分，C/C型最高(3.50±0.29)，其次為T/T型(2.68±0.16)，最后為T/C型(2.52±0.16)。但統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，基因型與活躍度間沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)。為了探討犬對主人的依戀程度是否與T471C的多態(tài)性存在一定的相關(guān)性，我們對所測試導(dǎo)盲犬被動測試兩種狀態(tài)下的活躍度與其基因型進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，被動測試的兩種狀態(tài)與T471C的多態(tài)性之間也沒有顯著相關(guān)性(P>0.05)。T/T型、T/C型和C/C型的活躍度均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。相對于主人在時，主人不在時的C/C型犬只活躍度有明顯升高的趨勢。主人在時的T/T型和T/C型犬只活躍度明顯低于主人不在時的活躍度。主人在時，T/T型和T/C型的活躍度集中在2～2.5分之間，主人不在時的活躍度集中在2.5～3分之間，而C/C型犬只的活躍度相比T/T型和T/C型要高出許多，集中在3～4分之間。尤其是，主人在時的C/C型犬只活躍度高于主人不在時。

圖5 基因型與活躍度的相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of the correlation between genotype and activity level

3 討論

導(dǎo)盲犬是視障人士的“眼睛和助手”，能夠協(xié)助視障人士正常出行、工作、學(xué)習(xí)、確保其能夠與周圍環(huán)境順利交流，是任何其他工具無法比擬的首選。目前育種犬和待訓(xùn)犬主要依據(jù)行為學(xué)測試的方法進(jìn)行篩選，該方法不但效率低下，而且消耗大量的人力、物力和財力，致使導(dǎo)盲犬的培訓(xùn)成功率低，成本居高不下[10]，是導(dǎo)盲犬培訓(xùn)道路上的一大障礙。因此，在犬培訓(xùn)前期，尋找有效可行的預(yù)測待訓(xùn)犬能否成為導(dǎo)盲犬的方法，對于提高培訓(xùn)成功率、降低培訓(xùn)成本具有現(xiàn)實的重要意義[11-12]。目前，導(dǎo)盲犬和育種犬的選育主要通過行為測試對其進(jìn)行評估，但測試結(jié)果受測試犬的生理狀態(tài)、測試人員的主觀判斷和環(huán)境變化等因素的影響，得出的結(jié)論可能會與實際有較大的偏差。這種工作方法帶有一定的主觀性，且效率低下，進(jìn)步也不明顯。依據(jù)犬行為特征的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，建立與犬性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，早期篩選適于訓(xùn)練使用的個體，就能有效地降低時間、節(jié)約成本，更能夠提高導(dǎo)盲犬的培訓(xùn)成功效率。

有相關(guān)研究表明SLC1A2基因與犬的活躍度有一定的關(guān)聯(lián)性，但目前并沒有更多的研究數(shù)據(jù)支持這一觀點[13]。而在篩選待訓(xùn)犬時，活躍程度是一個重要的評價指標(biāo)，犬的活躍度過高會導(dǎo)致犬的注意力不容易集中，且影響犬的穩(wěn)定性，而活躍度過低的犬，其工作意愿性比較差，都不利于培訓(xùn)成為導(dǎo)盲犬。本研究首先利用PT測試對99只犬的行為反應(yīng)進(jìn)行了一系列的考察和評分，從而對犬的活躍程度進(jìn)行評估。同時檢測了這99只犬SLC1A2的3個SNP位點的基因型。統(tǒng)計結(jié)果顯示，T129C位點的基因型全部是C/C型，T1549G位點也都是G/G型，該實驗結(jié)果表明這兩個位點不具有多態(tài)性，基因型相對比較保守，不易發(fā)生突變。而經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)T471C位點是一個同義突變的多態(tài)位點，有3種基因型，分別為T/T型、T/C型和C/C型。其中，T/T型的犬?dāng)?shù)量占大多數(shù)，其次是T/C型，C/C型的最少(僅有3只)。這一結(jié)果與Takeuchi等[8]的研究結(jié)果不符，他研究的樣本數(shù)據(jù)主要采集于日本當(dāng)?shù)?，因此，這種差異有可能是犬的血統(tǒng)或地域不同而引起的，也可能是導(dǎo)盲犬育種計劃的選擇性差異導(dǎo)致的。

我們對99只犬的品種、性別以及活躍度進(jìn)行的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，活躍度與品種間沒有顯著相關(guān)性，但是活躍度與性別之間存在顯著差異，表現(xiàn)為雄性犬的活躍度明顯高于雌性犬，這個結(jié)果與 Serpell and Hsu的研究結(jié)果相符合[14]。但也有與本研究結(jié)果相反的研究報道[8]，這種不符的結(jié)果有可能與訓(xùn)導(dǎo)員平時訓(xùn)練時使用的關(guān)鍵詞相關(guān)，也可能受地區(qū)環(huán)境和遺傳選擇的影響。

Takeuchi等人的研究結(jié)果顯示T471C的多態(tài)性與性別、活躍度具有顯著相關(guān)性[8]，而我們的研究結(jié)果表明，基因型與品種、性別和活躍度之間并不存在顯著相關(guān)。但是T/T型犬只的活躍度確實要比T/C型與C/C型犬只的活躍度高，而這與Takeuchi等人的研究結(jié)果卻相符，這表明T基因在犬的活躍水平上有一定的決定作用。另有研究表明，T471C與柴犬的攻擊性行為顯著相關(guān)[15]，而攻擊行為也屬于活躍度的范疇中，這種不一致性有可能是犬種差異和遺傳因素造成的，拉布拉多和金毛犬的性情天生就比較溫順、穩(wěn)定。我們的研究還分析了PT測試中的兩種狀態(tài)是否與T471C的多態(tài)性有一定的聯(lián)系，研究結(jié)果表明這兩者間并沒有顯著相關(guān)性。但是可以通過分析看出，犬對主人存在一定的依戀性，相對的主人對犬有一定的安撫作用。主人在時，犬在陌生環(huán)境中相對比較放松，顧忌較少，情緒上變化不是很大，性情比較穩(wěn)定。而當(dāng)主人離開時，犬會相對比較暴躁，相應(yīng)的其活躍度會增加，性情趨于不穩(wěn)定，嚴(yán)重者有可能產(chǎn)生分離焦慮。我們與C/C型犬只的訓(xùn)練情況進(jìn)行了比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3只犬都是拉布拉多犬，且其中有兩只已經(jīng)被淘汰，1只還在訓(xùn)練，而C/C型的活躍度過高確實不宜培訓(xùn)成為導(dǎo)盲犬。但由于樣本量過少，目前還不能確定該基因型是否能成為導(dǎo)盲犬前期篩選的一個指標(biāo)，還有待于大樣本的驗證。

綜上所述，活躍度與性別呈現(xiàn)顯著相關(guān)。SLC1A2基因T471C位點與導(dǎo)盲犬的活躍度不具有顯著相關(guān)性，不能作為導(dǎo)盲犬遺傳學(xué)篩選的指標(biāo)。