ICR小鼠體內(nèi)染色體畸變試驗的優(yōu)化*

霍桂桃 胡燕平 楊 瑩 趙婷婷 宋 捷 汪 祺 文海若

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

外源物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物與體內(nèi)DNA作用后可能產(chǎn)生損傷，其中不可修復(fù)的損傷隨DNA復(fù)制最終可誘導(dǎo)癌癥。發(fā)生于體細(xì)胞的染色體畸變是癌癥發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)。染色體畸變試驗(Chromosome Aberration Test,CAT)是一項以形態(tài)學(xué)觀察為主的檢測受試物對細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量潛在影響的經(jīng)典遺傳毒性評價方法，該方法的主要觀察內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)畸變(即染色體斷裂、易位、交換等)和數(shù)目畸變(非整倍體或多倍體的形成)[1-2]。與觀察突變或染色體損傷結(jié)果的小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗和微核試驗不同，染色體畸變試驗可以直接對染色體損傷的具體形式和程度進(jìn)行觀察，在遺傳毒理學(xué)研究中具有不可替代的作用。體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗是藥物、化妝品和醫(yī)療器械產(chǎn)品遺傳毒性評價中的常規(guī)試驗方法，而在新資源食品、食品添加劑和保健食品評價中通常開展嚙齒類動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗。此外，體內(nèi)染色體畸變試驗也是體內(nèi)微核結(jié)果為陽性或可疑陽性的受試物的后續(xù)試驗方法，并且在新藥評價中也會涉及[3]。

染色體畸變試驗的標(biāo)本制備和閱片工作較為繁瑣，而且需要一定的經(jīng)驗。能否通過適宜的試驗條件在捕捉染色體損傷峰值出現(xiàn)的同時保證良好的中期分裂相制片效果是獲得客觀評價結(jié)果的基石。如秋水仙素(Colchicine,COL)造模、低滲處理、高空滴片等過程，均會對中期分裂相的分散程度及制片效果產(chǎn)生影響[4-5]。在監(jiān)管領(lǐng)域中，用于藥物或保健食品的體內(nèi)染色體畸變試驗分析的中期分裂相細(xì)胞通常為骨髓中的有核細(xì)胞，且淋巴細(xì)胞占大多數(shù)。因淋巴細(xì)胞較體外試驗所用的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)、中國倉鼠肺細(xì)胞(China Hamster Lung，CHL)等細(xì)胞小，且每個細(xì)胞所需觀察的染色體條數(shù)多(小鼠淋巴細(xì)胞正常染色體數(shù)目約36～46條，CHL細(xì)胞正常染色體數(shù)目范圍是23～27條)，對體內(nèi)染色體畸變試驗的制片要求更高。OECD指導(dǎo)原則[6]建議嚙齒類動物體內(nèi)染色體畸變試驗如為單次給藥，應(yīng)分別在給藥后12～18 h和給藥后24 h以后分別取材；如為多次重復(fù)給藥，則可在末次給藥后12～18 h取材。指導(dǎo)原則建議在小鼠取材前3～5 h 給與秋水仙素，也有文獻(xiàn)報道秋水仙素的給藥時間可在取材前2 h?？梢娭笇?dǎo)原則僅對給藥方式和取材時間提出框架范圍，未作嚴(yán)格規(guī)定。而文獻(xiàn)報道所用的試驗條件各不相同。用于申報的試驗數(shù)據(jù)，通常需來自標(biāo)準(zhǔn)化的試驗流程，從而保證數(shù)據(jù)的有效性。故有必要比較不同的給藥、取材方式對制片及觀察結(jié)果的影響，從而對試驗條件進(jìn)行優(yōu)化，使研究數(shù)據(jù)更好地為“三品一械”的監(jiān)管服務(wù)。這也是本研究的重要意義所在。

雖然根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)頒布的指導(dǎo)原則[7]和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[8]，無論大鼠或小鼠均可用于體內(nèi)染色體畸變試驗，但實際應(yīng)用中多用小鼠。對于微核試驗出現(xiàn)可疑陽性的藥物來說，為與微核試驗結(jié)果作有效對比，需使用ICR小鼠股骨骨髓細(xì)胞開展。因此本研究選擇微核試驗常用種屬，即ICR小鼠開展骨髓染色體畸變試驗，分別在不同時間點給予染色體斷裂劑CP 及中期分裂相造模試劑COL，比較不同給藥和取材時間點，以及不同給藥濃度對小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑：溶媒0.9%氯化鈉注射液(sodium chloride injection，NaCl)購自石家莊四藥有限公司；陽性試劑CP(批號：91K1176，純度≥純度1)購自Sigma Aldrich，給藥當(dāng)日現(xiàn)用現(xiàn)配，配制濃度為4 mg/mL；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)購自GIBCO公司；COL(批號：401181/151200,純度≥度11)購自 Fluka公司；氯化鉀(potassium chloride，KCl)購自Sigma Aldrich，使用去離子水配制為0.075 mol/L。Giemsa 染料購自Sigma Aldrich，臨染色前1份Giemsa原液經(jīng)9份1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液1∶1混合，pH6.8)稀釋配制為10% Giemsa應(yīng)用液。

1.1.2實驗動物：SPF級ICR(CD-1)小鼠36只，給藥時7～8周齡(購入時6～7周齡，體質(zhì)量30～32 g，檢疫期7 d)，均為雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011。動物在恒溫(20～26)℃、恒濕(40%～70%)、各12小時明暗周期的條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)密度為2～3只/籠。給予鼠全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。研究方案通過國家藥物安全評價監(jiān)測中心實驗動物福利倫理委員會的倫理審查。

1.1.3儀器：NTS-1300 恒溫振蕩水槽，東京理化器械株式會社；CX-41光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥：36只小鼠購入后在檢疫期第7天，根據(jù)體質(zhì)量使用TOXSTAT2006數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件隨機(jī)分組，分組時個體體質(zhì)量差異不得大于平均體質(zhì)量的±20%。全部動物首先分為給藥后18 h取材組和給藥后24 h取材組，每組下設(shè)COL 4 mg/kg組(取材前4 h給予)和COL 10 mg/kg組(取材前2 h給予)給藥組。不同COL濃度組以下，再分別設(shè)0.9% 氯化鈉注射液溶媒對照組、CP 10 mg/kg組和CP 40 mg/kg組，每組3只。COL及CP取材時間及使用劑量根據(jù)指導(dǎo)原則及文獻(xiàn)報道確定[3,9]。給藥方式均為腹腔注射，給藥體積均為10 mL/kg。試驗設(shè)計詳見表1。

1.2.2臨床癥狀觀察及體質(zhì)量測定：給藥期間每天上午和下午對所有動物進(jìn)行隔籠觀察，包括是否死亡、瀕死、活動狀況、外觀及被毛、有無外傷、糞便情況等；給藥前、給藥期間及解剖前對動物進(jìn)行稱重。

1.2.3取材及標(biāo)本制作：在動物解剖取材日，采用CO2吸入法麻醉處死動物，然后摘取雙側(cè)股骨制作骨髓標(biāo)本。用胎牛血清將股骨中骨髓沖下制備骨髓細(xì)胞懸液；將骨髓懸液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，棄去大部分上清液，留適量上清將骨髓細(xì)胞沉淀充分吹打均勻；每個樣本中加入7 mL 37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl溶液,輕輕混勻細(xì)胞后，將樣本置于37 ℃條件下低滲處理約40～60 min。低滲處理后，加入固定液(甲醇∶冰醋酸比例約3∶1)3 mL預(yù)固定樣本，以1 000 r/min離心10 min，棄上清;加入3 mL固定液，固定20 min后以1 000 r/min離心5 min，棄上清；用吸管將細(xì)胞團(tuán)塊打碎，加入5 mL固定液，37 ℃水浴固定20 min后以1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入0.5 mL固定液，將沉淀物吹打混勻。滴片(30 cm左右高度滴4～5滴在預(yù)冷的玻片上，細(xì)胞自然分散)制備標(biāo)本(3～5張/只)，室溫自然風(fēng)干。

表1 分組及試驗設(shè)計Table 1 Grouping and test design

10%Giemsa(1份Giemsa原液與9份pH6.8磷酸緩沖液混合)染色30 min后，以蒸餾水或自來水沖洗玻片。染色后的玻片存放于標(biāo)本盒中待鏡檢觀察。

1.2.4取材及標(biāo)本制作:取染色玻片標(biāo)本，在顯微鏡下(放大倍數(shù)為400～1 000倍)進(jìn)行觀察。每只動物至少分析100個中期分裂相細(xì)胞。記錄每個細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)畸變的畸變類型，包括染色單體裂隙(ctg)、染色體單體斷裂(ctb)、染色單體交換(cte)、染色體裂隙(csg)、染色體斷裂(csb)、染色體交換(cse)、碎片化(frg，可見10個以上斷片)，及是否為多倍體(pol)。根據(jù)以上結(jié)果計算出各組平均結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞率(不含ctg及csg，AC%)、結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞率(含ctg及csg，ACG%)、多畸變細(xì)胞率(不含ctg及csg，MAC%)及多倍體細(xì)胞率(PC%)。正常骨髓有核細(xì)胞及存在結(jié)構(gòu)畸變和數(shù)目畸變的骨髓有核細(xì)胞中期相染色體圖例如圖1所示。

圖1 正常及異常ICR小鼠骨髓細(xì)胞染色體注：ICR小鼠骨髓染色體標(biāo)本經(jīng)Giemsa染色后，在油鏡(×1000)下觀察到的正常染色體(A)、結(jié)構(gòu)異常(B-C，包括裂隙及斷裂)及多倍體(D)結(jié)構(gòu)示意。Fig.1 Normal and aberrated chromosome in ICR mouse bone marrow cellsNote：The normal chromosome (A),structural abnormalities (B-C,including gaps and breakage)and polyploid (D)observed in the ICR mouse bone marrow chromosome specimens after the Giemsa staining under an oil immersion lens(×1000).

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 整體毒性評價

給藥后試驗動物的臨床癥狀觀察和體質(zhì)量變化是衡量受試物對動物毒性程度的重要指標(biāo)。實驗期間各組動物未見與給藥相關(guān)的異常臨床癥狀或死亡。各組動物的體質(zhì)量在各個時間點與同期本組對照組動物相比未見差異(P>0.05，表2)，提示本研究所選用的CP及COL濃度對動物整體無明顯直接毒性作用，給藥方式可行。

表2 各組動物體質(zhì)量測定結(jié)果Table 2 Body weight measurement results of each group

注：單因素方差分析
Notes:one-way ANOVA

2.2 染色體畸變分析結(jié)果

2.2.1不同給藥濃度及取材時間點染色體畸變類型的關(guān)系

與各小組內(nèi)的溶媒對照組相比(表3及圖2)CP18 h-COL4h組、CP18 h-COL2h組、CP24 h-COL4h組、CP24 h-COL2h組的AC%、AGC%和MAC%均顯著性升高(P<0.01)；每小組內(nèi)CP高劑量組AC%顯著性高于CP低劑量組(P<0.01)，CP劑量較高時產(chǎn)生的染色體畸變更為嚴(yán)重，與陽性劑CP的預(yù)期結(jié)果相符。試驗期間低劑量給藥2次，高劑量給藥1次，因此上述結(jié)果也提示 CP所致染色體畸變與給藥次數(shù)關(guān)系較小，與單次給藥濃度和給藥時間點關(guān)系較大。從COL使用劑量及取材時間角度分析，CP18 h-COL4h組的AC%、ACG%和MAC%均低于CP18 h-COL2h組，并存在顯著性差異(P<0.05)，提示使用高劑量的COL(10 mg/kg)盡管作用時間縮短，亦可產(chǎn)生額外的染色體損傷。

圖2 不同給藥濃度及取材時間點與染色體畸變類型分布的關(guān)系注：不同給藥取材方式對各組平均AC%(不含ctg及csg,A)、ACG%(含ctg及csg，B)、MAC%(不含ctg及csg，C)及PC%(D)的影響?？ǚ綑z驗，與同給藥取材時間點溶媒對照組比較。*P<0.05,**P<0.01；動物數(shù)n=3Fig.2 Relationship between different dose concentrations and sampling time points and distribution of chromosome aberration typesNote：The effects of different administration and sampling strategies on the average AC% (excluding ctg and csg,A),ACG% (including ctg and csg,B),MAC% (excluding ctg and csg,C)and PC% (D)of each group.Chi-square test，Compared with the vehicle control group at the same administration and sampling time point,* indicates P<0.05 compared with vehicle control group；**indicates P<0.01 compared with vehicle control group.The number of animals n=3.

然而，PC%未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)相關(guān)性。與各小組內(nèi)的溶媒對照組相比，CP18 h-COL4h組、CP18 h-COL2h組的PC%未見明顯升高(P>0.05)；而CP24 h-COL4h組中，CP低、高劑量組PC%均顯著性降低(P<0.05,P<0.01)，可能與該作用條件下導(dǎo)致大量染色體斷裂，多倍體數(shù)相對降低有關(guān)。溶媒對照組染色體結(jié)構(gòu)畸變較少，分散相更為清晰且結(jié)構(gòu)相對完整，故更易觀察到多倍體的現(xiàn)象。因多倍體細(xì)胞數(shù)與使用COL有關(guān)，染色體畸變試驗結(jié)果無法對受試物是否誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生作判斷。

2.2.2不同CP給藥濃度下染色體結(jié)構(gòu)畸變類型分布關(guān)系

針對不同的結(jié)構(gòu)畸變類型(裂隙、斷裂和交換)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表3與圖3)，溶媒對照組中的結(jié)構(gòu)性畸變類型絕大多數(shù)為裂隙，斷裂較少，未見染色體交換；CP低劑量組中3類結(jié)構(gòu)性畸變數(shù)目明顯增加，雖大多數(shù)畸變?nèi)员憩F(xiàn)為裂隙，但斷裂和交換的出現(xiàn)率相加可與之持平；在CP高劑量組中3類染色體畸變數(shù)量相近，染色體交換數(shù)目明顯增加。以上趨勢在4個不同給藥取材點均可觀察到。染色單體及染色體裂隙認(rèn)為是可修復(fù)的畸變類型，通常不計入結(jié)構(gòu)畸變統(tǒng)計中；而染色體單體及染色體斷裂是CP的最主要畸變類型，上述結(jié)果與預(yù)期及文獻(xiàn)報道基本相符[9]。

圖3 不同CP給藥劑量與染色體結(jié)構(gòu)畸變類型分布關(guān)系注：溶媒對照組(A)、10 mg/kg CP組(B)與40 mg/kg CP組(C)各300個細(xì)胞中裂隙、斷裂及交換數(shù)匯總，動物數(shù)n=3Fig.3 Distribution of Chromosome structural aberrations in different doses of CPNote：Summary of numbers of gaps,breaks and exchanges in 300 cells of vehicle control group (A)、10 mg/kg CP group (B)and 40 mg/kg CP group (C),respectively.The number of animals n=3

表3 染色體畸變分析結(jié)果Table 3 Chromosome aberration analysis results

注：1.每組3只動物，各分析100個中期分裂相細(xì)胞，每組共統(tǒng)計300個細(xì)胞.2.ctg、ctb、cte：分別表示染色單體裂隙、斷裂、交換；csg、csb、cse：分別表示染色體裂隙、斷裂、交換；frg：10個以上斷片(含交換).3.AC：結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞數(shù)(不包括裂隙)；ACG：結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞數(shù)(包括裂隙)；MAC：多畸變細(xì)胞數(shù)(不包括裂隙)；PC：多倍體細(xì)胞數(shù).卡方檢驗，同組0.9% NaCl對照組：*P<0.05,**P<0.01；同組CP低劑量組：#P<0.01；同劑量CP 18 h組：△P<0.05,△△P<0.01；同劑量COL組▲P<0.01
Notes：1.3 animals per group,Analysis of 100 metaphase dividing cells.A total of 300 cells were counted in each group.2.ctg/csg,ctb/csb and cte/cse represent chromatid gap/chromosome gap,chromatid break/chromosome break and chromatid exchange/chromosome exchange respectively.frg:represent more than 10 fragments (including exchange).3.AC:aberration cell (include gap);ACG:aberration cell (exclude gap);MAC:multiple aberration cell (exclude gap);PC:polyploidy cell.;Chi-square test showed that 0.9% NaCl control group in the same group;*indicatesP<0.05 compared with vehicle control group;**indicatesP<0.01 compared with vehicle control group;#indicatesP<0.01 compared with Low dose group of CP in the same group;△indicatesP<0.05 compared with the same dose of CP for 18 h group;△△indicatesP<0.01 compared with the same dose of CP for 18 h group;▲indicatesP<0.01 compared with the same dose of COL group

3 討論

與體外哺乳動物染色體畸變試驗相比，體內(nèi)試驗所觀察的嚙齒類動物淋巴細(xì)胞所包含的染色體條數(shù)較多而細(xì)胞較小，因此后者需制備分散情況更好的染色體標(biāo)本用于觀察。中期分裂相細(xì)胞染色體分散情況主要與給藥時間點、取材時間點、給藥濃度、低滲處理條件等有關(guān)[10-11]。本研究主要就不同的給藥劑量，給藥時間及取材時間對制片效果的影響進(jìn)行對比。

染色體畸變試驗的觀察對象為處于中期分裂相的細(xì)胞，為增加中期分裂相細(xì)胞比例，早期研究中使用植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)刺激細(xì)胞分裂，提高骨髓和淋巴細(xì)胞等的分裂指數(shù)[12]。OECD指導(dǎo)原則中建議使用紡錘絲形成抑制劑COL來獲得更多的中期分裂相細(xì)胞用于分析[6]。但COL同時也是染色體畸變的陽性劑，其劑量過高時可導(dǎo)致細(xì)胞核固縮，反而干擾了制片后染色體的分散效果，難以對畸變類型進(jìn)行細(xì)致的觀察[13-14]。OECD指導(dǎo)原則及我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)均建議的秋水仙素給藥時間為取材前3～5 h。而國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中秋水仙素實際使用劑量2～4 mg/kg不等[15-18]；為便于操作，給藥時間為取材前為1.5～4 h。本研究的結(jié)果提示雖然無論取材前4 h(4 mg/kg)或2 h(10 mg/kg)給予COL,每只動物均可獲得至少100個處于中期分裂相的細(xì)胞，但10 mg/kg的COL可誘導(dǎo)額外的染色體結(jié)構(gòu)性畸變。而CP 18 h-COL 4 h組與CP 18 h-COL 2 h組染色體樣本中染色體分散效果較好，鏡下可觀察到較多處于中期分裂相的細(xì)胞(約占總有核細(xì)胞數(shù)的10%左右，數(shù)據(jù)未顯示)。

在CP的給藥劑量和時間的選擇方面，由于CP處理導(dǎo)致染色體出現(xiàn)較多結(jié)構(gòu)性斷裂，滴片時易將多數(shù)已脹裂核膜的染色體標(biāo)本斷片進(jìn)一步摔碎，無法觀察。因鏡下觀察陽性劑量組染色體標(biāo)本核膜脹裂不充分的情況相對較多，試驗時應(yīng)合理設(shè)置CP的給藥劑量。此外，CP 24 h-COL 4 h組和CP 24 h-COL 2 h組兩組染色體分散效果相對較差，可見未成熟染色體凝縮現(xiàn)象，多見染色體細(xì)長，從而影響了染色體分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。上述情況均與給藥取材時間點與細(xì)胞周期不協(xié)同有關(guān)，因大多數(shù)細(xì)胞未處于細(xì)胞分裂中期。在這一條件下，某些結(jié)構(gòu)性畸變可能被忽視，裂隙與斷裂的差異則難以區(qū)分，故陰性對照組的畸變率較低，CP 24 h-COL 4 h組和CP 24 h-COL 2 h組中的結(jié)構(gòu)畸變率可能被低估。如圖2所示，CP 24 h-COL 2 h組的CP低劑量組與高劑量組間的結(jié)構(gòu)性畸變率差異被弱化；CP 24 h-COL 4 h組的CP高劑量組的AC%較CP 18 h-COL 4 h組的CP高劑量組顯著增高(圖3)。故取材和給藥時間設(shè)為CP在取材前18 h給藥，COL在取材前4 h給藥較為理想。

除了給藥及取材因素外，其它制片流程也可能影響染色體分散效果。如，制片所用玻片，建議提前使用95%酒精浸泡擦拭，從而減少背景沉渣。骨髓染色體樣本經(jīng)37 ℃條件下低滲處理30至60 min可完全脹裂溶解紅細(xì)胞，并充分脹裂白細(xì)胞核膜。此外，滴片高度也對染色體分散程度有一定影響。

2011年在人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)頒布的藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則的修訂草案ICH S2(R1)[19]中強(qiáng)調(diào)了體內(nèi)研究可將多種遺傳毒性評價方法聯(lián)合開展。在藥物安全性評價領(lǐng)域，通常在骨髓微核試驗結(jié)果不明確或為陽性時開展體內(nèi)染色體畸變試驗，對受試物對體內(nèi)染色體損傷效應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。本研究結(jié)果提示間隔24 h連續(xù)兩次給藥后18 h取材可獲得較優(yōu)的染色體畸變試驗制片效果，而骨髓微核試驗亦可使用相同的給藥及取材方式。故兩者可使用同一批動物開展，從而更好地對微核試驗的結(jié)果進(jìn)行驗證。而實際給藥頻率和給藥方式要根據(jù)不同受試物的實際人體使用方式、劑型、作用機(jī)制或國標(biāo)要求進(jìn)行調(diào)整。本研究對試驗條件的摸索積累了一定的背景數(shù)據(jù)，也為相關(guān)研究人員提供借鑒。此外，結(jié)果提示間隔24 h連續(xù)兩次給藥后18 h取材可獲得較優(yōu)的制片效果。