miR-595在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后評(píng)估的價(jià)值①

蘇紅娥 鐘慶吉 符春麗 薛萬(wàn)興 林 元

(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，那大 571799)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢惡性腫瘤的主要病理類型，其發(fā)病隱匿，病情進(jìn)展迅速，病死率較高，對(duì)女性的生命健康造成極大的危害[1]。目前，仍沒(méi)有理想的生物學(xué)指標(biāo)可以用于EOC的早期診斷、指導(dǎo)治療及預(yù)后評(píng)估。近期的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在細(xì)胞分化、增殖、控制細(xì)胞周期、凋亡和新陳代謝等過(guò)程中的基因調(diào)控中起到重要作用，其中miR-595在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并能通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2,3]。本研究通過(guò)檢測(cè)EOC組織及癌旁正常組織中miR-595表達(dá)水平，分析其表達(dá)與EOC患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系，旨在為評(píng)估EOC預(yù)后及靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2013年1月至2015年12月海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科收治行手術(shù)治療的EOC患者150例，年齡30～76歲，平均(54.30±10.72)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為EOC并適合手術(shù)治療者；②能配合本次研究及病歷資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①隨訪過(guò)程中失訪，病歷資料不完整者；②術(shù)前已行放療、化療或激素治療者；③術(shù)前有急慢性感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及其他惡性腫瘤。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1研究方法 采用前瞻性研究方法對(duì)150例患者進(jìn)行隨訪，隨訪起始時(shí)間為患者自術(shù)后第1天的時(shí)間，通過(guò)電話或門診等方式對(duì)患者進(jìn)行調(diào)查，截止時(shí)間為2018年12月31日?？偵鏁r(shí)間(Overall survival,OS)定義為術(shù)后第1天至患者死亡的時(shí)間。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(Progression-free survival,PFS)定義為術(shù)后第1天起，未發(fā)生復(fù)發(fā)、原發(fā)器官腫瘤轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時(shí)間。納入本研究的變量包括患者年齡、絕經(jīng)情況、臨床分期、病理類型、病理分級(jí)、深肌層浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及生存時(shí)間等。

1.2.2標(biāo)本采集及RNA提取 癌組織取肉眼所見(jiàn)的明顯腫瘤組織，癌旁正常組織取距離腫瘤邊緣3 cm 的良性卵巢組織，所取組織標(biāo)本離體后置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍后置-80℃保存。取標(biāo)本約100 mg，采用液氮研磨法將組織磨成粉末，然后加入約1 ml的Trizol裂解組織試劑，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

1.2.3miR-595逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉(zhuǎn)錄已定量的RNA，選用U6作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為15 μl：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無(wú)菌三蒸水。反應(yīng)參數(shù)為：16℃反應(yīng)30 min，42℃反應(yīng)30 min，85℃反應(yīng)5 min，4℃恒溫放置保存，每個(gè)反應(yīng)均為1個(gè)循環(huán)。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應(yīng)體系為20 μl：1 μl 引物及探針Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μl 無(wú)核酸酶的水。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s、60℃復(fù)性60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-595的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，其中ΔCt為Ct靶基因與Ct內(nèi)參基因(U6)的差值，2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基因表達(dá)的差異倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1EOC組織和癌旁正常組織miR-595表達(dá)水平比較 EOC組織miR-595表達(dá)水平(2.80±0.74)明顯低于癌旁正常組織(6.93±1.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.835，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 EOC組織和癌旁正常組織miR-595表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of miRNA-595 between EOC and normal tissues adjacent to

2.2確定miR-595的最佳界值 根據(jù)miR-595繪制EOC患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的ROC曲線，當(dāng)miR-595取2.68時(shí)，約登指數(shù)最大。以2.68為miR-595的最佳截點(diǎn)，其評(píng)估EOC患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的敏感度為81.6%，特異度為75.2%，曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.814。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-595繪制EOC患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的ROC曲線Fig.2 miR-595 plots ROC curves of recurrence and survival in EOC patients

2.3高miR-595組與低miR-595組EOC患者的臨床病理特征比較 以miR-595=2.68為界值，將150例EOC患者分為高miR-595組(miR-595≥2.68，n=68)，低miR-595組(miR-595<2.68，n=82)。高miR-595組與低miR-595組的FIGO分期、病理分級(jí)、深肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而兩組的年齡、絕經(jīng)、組織學(xué)類型及腫瘤直徑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 高miR-595組與低miR-595組EOC患者的臨床病理特征比較Tab.1 Comparison of clinicopathological features of EOC patients between high miR-595 group and low miR-595 group

2.4miR-595表達(dá)與EOC患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的關(guān)系 150例EOC患者隨訪時(shí)間10～68個(gè)月，中位隨訪時(shí)間27.5個(gè)月。生存分析顯示，低miR-595組患者總生存率明顯低于高miR-595組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(46.5% vs 66.3%；Log-rankχ2=7.914，P<0.01)，見(jiàn)圖3；低miR-595組患者無(wú)進(jìn)展生存率明顯低于高miR-595組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (24.2% vs 53.6%；Log-rankχ2=10.627，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖3 高miR-595組與低miR-595組EOC患者總生存時(shí)間曲線比較Fig.3 Total survival time curves of EOC patients in high and low miR-595 groups

圖4 高miR-595組與低miR-595組EOC患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間曲線比較Fig.4 Comparison of progression-free survival curves between high-miR-595 group and low-miR-595 group of EOC patients

對(duì)單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素調(diào)入COX回歸分析模型，結(jié)果顯示FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-595<2.68是影響EOC患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[HR(95%CI)=2.726(2.105～3.824)、3.115(2.583～4.318)、3.748(3.204～6.725)]。見(jiàn)表2。

表2 影響EOC患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的單因素及多因素COX回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate COX regression analysis on survival and recurrence of EOC patients

3 討論

EOC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因改變的過(guò)程，多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)失?；蚴Ш猓瑢?dǎo)致細(xì)胞無(wú)控增殖在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸上起關(guān)鍵作用。miRNA是一類長(zhǎng)度為21～25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子，可激活多種胞內(nèi)信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過(guò)程，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，有望成為治療腫瘤患者的重要靶點(diǎn)[4，5]。有研究表明，miRNA在EOC中異常表達(dá)，與EOC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為EOC早期診斷和預(yù)后判斷的新型標(biāo)志物[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-595可以通過(guò)多種信號(hào)通路在細(xì)胞周期、超甲基化、血管生成等方面促進(jìn)或抑制惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和耐藥等多個(gè)階段，有可能為惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷提供了新的靶點(diǎn)和思路[7，8]。Hao等[9]研究顯示，高表達(dá)miR-595導(dǎo)致SOX7下調(diào)，從而抑制了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，提示miR-595可能在癌癥中發(fā)揮了腫瘤抑制基因作用。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了miR-595在EOC進(jìn)展中的作用，然而，miR-595能否作為一種有前景的EOC預(yù)后的生物標(biāo)志物仍然存在未知。

本研究結(jié)果顯示，EOC組織與癌旁正常組織相比，EOC組織中的miR-595表達(dá)顯著降低(P<0.05)，提示miR-595可能是一種抑癌基因，其表達(dá)下降可能參與EOC的發(fā)生發(fā)展。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-595隨著EOC臨床分期及組織分化的進(jìn)展，miR-595表達(dá)水平呈明顯降低。而且miR-595表達(dá)水平還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-595表達(dá)水平明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表明miR-595與EOC較差的臨床病理特征有關(guān)。分析其原因可能是臨床病理特征較差的患者病情進(jìn)展較快，腫瘤組織可抑制更多的具有抑癌基因作用的miR-595進(jìn)入血液，同時(shí)可促進(jìn)機(jī)體具有癌基因作用的miRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體miR-595表達(dá)水平異常降低。Azizmohammadi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)在EOC組織中較癌旁正常組織降低，且miRNA低表達(dá)與高組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高FIGO分期有關(guān)，是EOC患者總生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。另有研究表明，miRNA在EOC組織中呈低表達(dá)，且與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，是預(yù)測(cè)EOC復(fù)發(fā)的一個(gè)很有前景的指標(biāo)[11]。本研究進(jìn)一步探討miR-595與EOC患者預(yù)后的臨床價(jià)值，并分析miR-595表達(dá)與生存時(shí)間之間的關(guān)系，結(jié)果顯示低miR-595組患者總生存率明顯低于高miR-595組，低miR-595組患者無(wú)病生存率明顯低于高miR-595組，說(shuō)明miR-595低表達(dá)與EOC患者生存期短有關(guān)。此外，多因素COX回歸模型分析顯示，高FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-595<2.68是影響EOC患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Zhou等[12]研究顯示，miR-595低表達(dá)是EOC患者總生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，提示miR-595可能是一種潛在的預(yù)測(cè)EOC預(yù)后的生物標(biāo)志物。Wan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA低表達(dá)對(duì)EOC患者總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率有顯著影響(P<0.05)，miRNA可以作為一種評(píng)估EOC患者預(yù)后的有效指標(biāo)。Pan等[14]研究表明，miRNA通過(guò)影響細(xì)胞增殖和凋亡參與EOC的發(fā)生發(fā)展，而且與EOC患者的總生存率相關(guān)。亦有研究認(rèn)為，在EOC中，miRNA高表抑制了細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展，miRNA低表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率較低有關(guān)，是影響EOC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。

綜上所述，F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-595<2.68是影響EOC患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-595<2.68對(duì)EOC患者術(shù)后的預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值，有望作為預(yù)測(cè)EOC預(yù)后的新型標(biāo)志物，同時(shí)也能更好地指導(dǎo)臨床治療。但本研究為單中心研究，且miR-595的臨界值尚無(wú)明確的范圍，未來(lái)仍需大樣本、多中心試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)miR-595對(duì)EOC預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值。