應(yīng)用新型微陣列芯片法檢測(cè)呼吸道過(guò)敏疾病患者過(guò)敏原譜①

黃志鋒 羅文婷 廖陳喜 陳 浩 胡海圣 孫寶清

(廣州呼吸健康研究院，呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家呼吸臨床研究中心，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 510120)

Ⅰ型過(guò)敏性疾病是一類(lèi)由IgE介導(dǎo)的全身性疾病，涉及多器官和多系統(tǒng)[1]。過(guò)敏性鼻炎和哮喘是最常見(jiàn)的氣道過(guò)敏性疾病，因它們屬于同一個(gè)氣道，具有一些共同的臨床特征被稱(chēng)為聯(lián)合呼吸道疾病(United Airways Diseases,UADs)[2,3]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告稱(chēng)，全世界約有3億和4億患者分別患有哮喘和過(guò)敏性鼻炎[4,5]，并且這一患病人數(shù)還在不斷增長(zhǎng)，尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家[6]。而病因診斷的局限性導(dǎo)致過(guò)敏性鼻炎和哮喘患者的癥狀反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此明確氣道過(guò)敏原在UADs診治防治中起著非常重要的作用。目前已經(jīng)確定免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)在Ⅰ型過(guò)敏疾患中顯著升高[7,8]。過(guò)敏原的篩查可以通過(guò)血清特異性IgE(specific IgE,sIgE)的濃度或使用高純度過(guò)敏原提取物進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(Skin Prick Test,SPT)來(lái)確定，而體外血清sIgE測(cè)試不受患者皮膚、服藥等因素的干擾，有效避免了個(gè)體差異帶來(lái)的結(jié)果不確定性及不良反應(yīng)的發(fā)生，已成為過(guò)敏原檢測(cè)的最主要工具[7]。

長(zhǎng)期以來(lái)，臨床應(yīng)用的sIgE定量檢測(cè)系統(tǒng)較少，以Thermo Fisher的ImmunoCAP系統(tǒng)較為常見(jiàn)，該系統(tǒng)采用熒光酶聯(lián)免疫法，是目前國(guó)際認(rèn)可的過(guò)敏原sIgE檢測(cè)方法[10]；但該系統(tǒng)花費(fèi)成本較高，在國(guó)內(nèi)很難大范圍推廣。微陣列化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(BioIC chemiluminescence immunoassay,BioIC)因其血清樣品需求量少，檢測(cè)成本低，可同時(shí)檢測(cè)多種過(guò)敏原sIgE的特點(diǎn)而具有良好的臨床應(yīng)用前景[11]；高通量檢測(cè)過(guò)敏原的sIgE可以提供與臨床診斷相關(guān)的過(guò)敏原信息，并可以幫助患者預(yù)知某些還沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀低水平sIgE陽(yáng)性過(guò)敏原的風(fēng)險(xiǎn)。本研究首次采用微流控技術(shù)搭載化學(xué)發(fā)光應(yīng)用于檢測(cè)過(guò)敏原sIgE，檢測(cè)19項(xiàng)過(guò)敏原sIgE，結(jié)合本地區(qū)過(guò)敏原分布特點(diǎn)分析過(guò)敏原譜及共致敏現(xiàn)象，為臨床診斷提供相關(guān)信息。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 2016年1月～2018年12月就診于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，確診為過(guò)敏性鼻炎和(或)哮喘患者，并經(jīng)ImmunoCAP 1000系統(tǒng)檢測(cè)血清sIgE為多重過(guò)敏原陽(yáng)性(包括塵螨，蟑螂、動(dòng)物毛發(fā)和蝦蟹等常見(jiàn)過(guò)敏原)的患者血清245例。其中男143例、女102例，年齡分布為23(8,23)(中值，25%，75%)，年齡<18歲110例，≥18歲為135例。包括過(guò)敏性鼻炎患者92例，過(guò)敏性哮喘患者117例，過(guò)敏性鼻炎合并哮喘患者36例，三組患者的總IgE水平分布分別為322(198,741)，552(218,917)，781(301,1230)(見(jiàn)表1)。本研究及患者血清的使用經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)：GYYY-2016-73。

表1 根據(jù)不同疾病類(lèi)型描述患者基本信息Tab.1 Patient demographic characteristics based on different diseases

1.2實(shí)驗(yàn)方法 本研究采用BioIC檢測(cè)系統(tǒng)以利用類(lèi)似ELISA微量孔盤(pán)內(nèi)進(jìn)行的間接酶聯(lián)免疫冷光分析技術(shù)對(duì)血清過(guò)敏原sIgE進(jìn)行檢測(cè)，使用BioIC系統(tǒng)檢測(cè)19種sIgE過(guò)敏原僅需100 μl血清。所有患者均使用含分離凝膠的真空采血管抽取靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清后檢測(cè)，剩余血清標(biāo)本收集置于-80℃冰箱長(zhǎng)期存儲(chǔ)，避免反復(fù)凍融。進(jìn)行檢測(cè)前，將待檢血清提前取出于室溫放置約30 min，并使用震蕩儀混勻。

使用BioIC化學(xué)發(fā)光分析儀和過(guò)敏原特異性IgE抗體檢測(cè)試劑盒(洹藝科技，中國(guó)臺(tái)灣)測(cè)量血清過(guò)敏原sIgE，包括屋塵螨(d1)、粉塵螨(d2)、熱帶無(wú)爪螨(d201)、貓毛(e1)、狗毛(e5)、狗牙根草(g2)、梯牧草(g6)、蟑螂(i6)、煙曲霉菌(m3)、白色念珠菌(m5)、矮豚草(w1)、雞蛋(f1)、牛奶(f2)、小麥(f4)、大豆(f13)、花生(f14)、杏仁(f20)、蟹(f23)、蝦(f24)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)于未稀釋的血清樣品，檢測(cè)范圍為0.21～100 U/ml。使用0.35 U/ml作為陰陽(yáng)性閾值，sIgE結(jié)果≥ 0.35 U/ml則為陽(yáng)性。按RAST(Radioallegrosorbent test，RAST)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將sIgE陽(yáng)性結(jié)果分為1～6級(jí)：級(jí)別1(0.35～0.70 U/ml)，級(jí)別2(0.70～3.50 U/ml)，級(jí)別3(3.50～17.50 U/ml)，級(jí)別4(17.50～50.00 U/ml)，級(jí)別5(50.00～100.00 U/ml)，級(jí)別6(≥100.00 U/ml)。

使用Excel 2016(Microsoft?Excel?2016)和SPSS 23.0(IBM Corp.,Armonk,NY)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用柱狀圖表示各項(xiàng)過(guò)敏原的陽(yáng)性率分布，組間陽(yáng)性率差異采用卡方檢驗(yàn)(理論頻數(shù)出現(xiàn)<5則用fish確切概率法校準(zhǔn))，并采用Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較；以折線圖表示不同疾病人群合并致敏分布；對(duì)全部過(guò)敏原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后系統(tǒng)聚類(lèi)分析[12]，并以合適的界限將過(guò)敏原分為若干類(lèi)；使用Kendall`s Tau方法分析各項(xiàng)過(guò)敏原相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)時(shí)，< 0.21 U/ml，> 100 U/ml分別采用0，101進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P< 0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.119項(xiàng)過(guò)敏原sIgE致敏率分布情況 本研究招募的245例多過(guò)敏原致敏過(guò)敏性鼻炎/哮喘患者人群中，以塵螨(包括屋塵螨、粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨)和蟑螂為主要的吸入性過(guò)敏原，而蝦蟹和牛奶作為主要的食物過(guò)敏原。粉塵螨(86.94%)的陽(yáng)性率最高，其次為屋塵螨(84.49%)；吸入性過(guò)敏原中曲霉菌(1.63%)的陽(yáng)性率最低。食物過(guò)敏原中蟹(21.63%)陽(yáng)性率最高，雞蛋白(2.04%)的陽(yáng)性率最低(見(jiàn)圖1)。吸入性過(guò)敏原(91.02%)總體陽(yáng)性率顯著比食物過(guò)敏原(35.92%)總體陽(yáng)性率高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=160.417,P<0.01)。

2.2不同疾病患者人群致敏差異分析 按不同疾病類(lèi)型將研究患者分為鼻炎組、哮喘組和鼻炎合并哮喘組，觀察三組患者的各項(xiàng)過(guò)敏原致敏差異，并建立合并致敏項(xiàng)數(shù)折線圖。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)，三種疾病組的主要致敏過(guò)敏原均為三種螨蟲(chóng)和蟑螂，鼻炎合并哮喘組患者的貓毛、狗毛、蟑螂、蝦蟹過(guò)敏原陽(yáng)性率高于其他兩組疾病患者。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的狗毛陽(yáng)性率分別為14.13%，23.08%，38.89%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.371,P=0.009)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，鼻炎合并哮喘組和鼻炎組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的蟑螂陽(yáng)性率分別為26.09%、30.77%、52.78%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.66,P=0.013)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，鼻炎合并哮喘組與鼻炎組、哮喘組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的大豆陽(yáng)性率分別為1.09%、6.84%、11.11%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.713、P=0.026)；兩兩比較用Bonferroni法調(diào)整α水平后結(jié)果顯示，三種疾病組兩兩之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.022)。其余過(guò)敏原三種疾病組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 呼吸道過(guò)敏性疾病患者各項(xiàng)過(guò)敏原陽(yáng)性率分布Fig.1 Positive rate of allergens in patients with respiratory allergic diseasesNote:d1-Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

圖2 基于三種疾病人群的各項(xiàng)過(guò)敏原陽(yáng)性率分布Fig.2 Percentages of multiple allergen sensitization to Rhinitis,Asthma,Rhinitis with asthma groups

本研究納入的呼吸道過(guò)敏性疾病患者中有86.12%的患者為多過(guò)敏原致敏(合并過(guò)敏原陽(yáng)性項(xiàng)數(shù)≥2)；三組疾病患者多過(guò)敏原致敏百分比分別為鼻炎88.04%，哮喘84.62%，鼻炎合并哮喘86.11%，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。合并致敏項(xiàng)數(shù)折線圖結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，鼻炎合并哮喘組患者比單純鼻炎或單純哮喘的患者更可能同時(shí)對(duì)多種過(guò)敏原致敏。

圖3 基于三種疾病人群的多過(guò)敏原致敏百分比分析Fig.3 Number of multiple sensitization to AR,AS,AR&ASNote:*.P<0.05;d1.Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

2.3多重致敏的鼻炎/哮喘患者致敏模式和共同致敏現(xiàn)象探究 基于探索呼吸道疾病各種過(guò)敏原的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)BioIC系統(tǒng)檢測(cè)的245例患者19項(xiàng)過(guò)敏原sIgE進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，19項(xiàng)過(guò)敏可歸類(lèi)為5類(lèi)不同致敏模式：第一類(lèi)：屋塵螨/粉塵螨/熱帶螨/蟹/蝦/蟑螂；第二類(lèi)：狗牙根草/梯牧草/小麥/大豆/花生/矮豚草/杏仁；第三類(lèi)：貓毛/狗毛/牛奶；第四類(lèi)：曲霉菌/白色念珠菌；第五類(lèi)：雞蛋白(見(jiàn)圖4)。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果：屋塵螨/粉塵螨/熱帶螨/蟹/蝦/蟑螂的相關(guān)性在0.857≥ rk.≥0.222,P<0.01，其中三項(xiàng)螨蟲(chóng)之間相關(guān)性較好，rk.≥0.553,P<0.01；狗牙根草/梯牧草/小麥/大豆/花生/矮豚草/杏仁的相關(guān)性在0.837≥ rk.≥0.232,P<0.01，該類(lèi)的所有過(guò)敏原同源于植物界；貓毛/狗毛/牛奶的相關(guān)性在0.432≥ rk.≥0.284,P<0.01；曲霉菌/白色念珠菌相關(guān)性為rk.= 0.302,P<0.01。

圖4 系統(tǒng)聚類(lèi)分析譜系圖及Kendall`s Tau相關(guān)性分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis dendrogram and Kendall`s Tau correlation analysisNote:d1.Der.Pteronyssinus;d2.Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

表2 各類(lèi)致敏模式共致敏現(xiàn)象分析Tab.2 Analysis of co-sensitization phenomena in various sensitization modes

進(jìn)一步分析各類(lèi)致敏模式中過(guò)敏原共致敏情況(見(jiàn)表2)，四類(lèi)致敏模式中，類(lèi)別內(nèi)任一項(xiàng)過(guò)敏原合并其他過(guò)敏原陽(yáng)性的百分率分別為95.35%(205/215),67.44%(29/43),43.53%(37/85)和16.67%(2/12)；而類(lèi)別內(nèi)全部過(guò)敏原同時(shí)陽(yáng)性的百分率則一般，均<16.67%。

3 討論

本研究結(jié)果顯示塵螨(包括屋塵螨、粉塵螨和熱帶無(wú)爪螨)是呼吸道過(guò)敏癥患者的主要過(guò)敏原，其次是蟑螂，貓毛和狗毛過(guò)敏原，這與先前研究的結(jié)果報(bào)道基本一致[13-15]。Li等[16]在一項(xiàng)全國(guó)多中心研究報(bào)道塵螨是中國(guó)最常見(jiàn)的室內(nèi)氣傳播過(guò)敏原，并且在其入選的所有過(guò)敏性疾病患者中對(duì)1種或多種塵螨過(guò)敏原SPT陽(yáng)性率達(dá)87.2%。本研究中的患者均來(lái)自廣東省會(huì)城市廣州(南部沿海地區(qū))，屬高溫高濕的亞熱帶季風(fēng)氣候，這種環(huán)境適合塵螨的生長(zhǎng)繁殖[17]，這也解釋了本研究患者中塵螨過(guò)敏原的普遍高致敏性，因此對(duì)于所有過(guò)敏性鼻炎和/或哮喘患者進(jìn)行塵螨過(guò)敏原規(guī)避的教育也是非常必要的。此外，蟑螂和貓狗毛過(guò)敏原在鼻炎和或哮喘患者中也有較高的陽(yáng)性率，并以吸入性過(guò)敏原(占91.02%)為主要引起呼吸道過(guò)敏癥，少數(shù)食物過(guò)敏原(35.92%)也參與這些疾病的發(fā)生。

對(duì)三組疾病人群陽(yáng)性率分析，發(fā)現(xiàn)鼻炎合并哮喘組患者對(duì)于大部分過(guò)敏原有較高的陽(yáng)性水平以及更有可能合并更多項(xiàng)次的過(guò)敏原同時(shí)致敏。應(yīng)用酶聯(lián)免疫捕獲法檢測(cè)廣州地區(qū)年齡1個(gè)月至86歲6419例患者變應(yīng)原sIgE水平，發(fā)現(xiàn)哮喘組、鼻炎組、哮喘合并鼻炎組的屋塵螨、粉塵螨、熱帶螨、蟑螂的致敏陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]；本研究哮喘患者屋塵螨、粉塵螨、熱帶螨的致敏陽(yáng)性率均低于其他兩組患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于大部分常見(jiàn)過(guò)敏原，三組患者均具有相似的陽(yáng)性率，提示過(guò)敏性鼻炎和哮喘兩者在病因、免疫學(xué)和發(fā)病機(jī)制等方面均非常相似，在過(guò)敏原分布上也具有一定的相似性。值得注意的是，過(guò)敏性鼻炎合并哮喘患者的貓毛、狗毛和蟑螂過(guò)敏原陽(yáng)性率顯著高于其他兩組患者，提示這三項(xiàng)過(guò)敏原可能會(huì)使得呼吸道過(guò)敏癥病程加重，或是引起多種呼吸道過(guò)敏癥同時(shí)發(fā)病。本研究未對(duì)患者的疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)定，因此未能結(jié)合病情嚴(yán)重程度進(jìn)一步分析。對(duì)三組疾病的多致敏情況進(jìn)行分析，過(guò)敏性鼻炎，哮喘，過(guò)敏性鼻炎合并哮喘患者的多致敏百分比分別為88.04%，84.62%、86.11%，并且鼻炎合并哮喘組患者比單純鼻炎或單純哮喘的患者更可能同時(shí)對(duì)多種過(guò)敏原致敏，提示有大部分過(guò)敏性鼻炎合并哮喘患者可同時(shí)對(duì)多種過(guò)敏原過(guò)敏，因此多過(guò)敏原致敏增加疾病的嚴(yán)重性。

多過(guò)敏原致敏可能由某些具有高度同源的過(guò)敏原之間的共同致敏或交叉反應(yīng)引起。我們通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)分析和Kendall`s Tau相關(guān)分析將19種常見(jiàn)過(guò)敏原分為5類(lèi)，以觀察各項(xiàng)過(guò)敏原之間的相似性。其中三種螨蟲(chóng)以及蟑螂和蝦蟹被納為第一類(lèi)，并且相關(guān)性分析結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)rK在0.222到0.857之間(P<0.01)；該類(lèi)中5項(xiàng)過(guò)敏原也是本研究中呼吸道過(guò)敏癥患者的主要吸入性過(guò)敏原和主要食物過(guò)敏原，并且已經(jīng)證實(shí)蝦蟹的主要致敏蛋白原肌球蛋白和螨的Der p10組分蛋白之間存在交叉過(guò)敏反應(yīng)[18,19]。狗牙根草、梯牧草、小麥、大豆、花生、矮豚草、杏仁同屬于第二類(lèi)過(guò)敏原，相關(guān)性rK在0.232至0.837之間；它們都屬于植物來(lái)源的花粉或食物過(guò)敏原，以往也有研究報(bào)道部分花粉過(guò)敏并伴發(fā)植物來(lái)源的食物過(guò)敏患者病例，并通過(guò)RAST抑制試驗(yàn)提示絕大多數(shù)花粉與植物來(lái)源的食物過(guò)敏原之間具有交叉反應(yīng)性[20]。貓狗毛和牛奶過(guò)敏原作為第三類(lèi)，其相關(guān)性也一般，貓毛和牛奶，狗毛和牛奶的Kendall`s Tau相關(guān)系數(shù)分別為0.284，0.364。目前國(guó)內(nèi)外較少報(bào)道寵物與牛奶過(guò)敏原之間的交叉過(guò)敏現(xiàn)象，在Mamikoglu等[21]的研究中，對(duì)已知寵物過(guò)敏的患者建議進(jìn)一步篩查對(duì)肉類(lèi)和牛奶過(guò)敏原。系統(tǒng)聚類(lèi)分析產(chǎn)生的5類(lèi)過(guò)敏原致敏模式中，類(lèi)別內(nèi)全部過(guò)敏原同時(shí)陽(yáng)性的百分率較低，而是表現(xiàn)為類(lèi)別內(nèi)某一項(xiàng)過(guò)敏原合并其他過(guò)敏原陽(yáng)性。

本研究存在一定的局限性，沒(méi)有收集患者病程病情等信息，無(wú)法將患者的患病嚴(yán)重與致敏模式進(jìn)行聯(lián)合討論，對(duì)于過(guò)敏原存在的交叉過(guò)敏探究也只停留在粗提物過(guò)敏原層面，在后續(xù)的研究中將引入組分診斷解決方案進(jìn)一步探討過(guò)敏原之間的平行致敏和交叉過(guò)敏現(xiàn)象。