宋佳玉 張清偉 孫明振 于江華 劉金寶 王慧芬 付秀虹
(漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,漯河 462002)
高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是導(dǎo)致宮頸病變的首要病因,但大多數(shù)的HPV感染為一過性,僅少部分高危型HPV持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸病變[1,2]。因此,宿主自身的免疫遺傳因素在高危型HPV感染的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中起著重要作用[3]??乖蔬f通路作為機(jī)體自身的免疫監(jiān)視系統(tǒng),在機(jī)體防御高危型HPV入侵的過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(Transporter associated with antigen processing,TAP)和低分子量蛋白酶體(Low molecular weight polypeptide,LMP)作為該通路的關(guān)鍵位點(diǎn)基因多態(tài)性,是否與高危HPV感染存在相關(guān)性目前鮮有報道。本研究首次對漯河市農(nóng)村婦女TAP1-637和LMP7-145多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測,探討其與高危HPV感染的相關(guān)性。
1.1一般資料 選取2016年9月~2017年12月漯河市農(nóng)村婦女免費(fèi)宮頸癌篩查中,確診為高危HPV感染者258例和未感染者228例為研究對象,將其分為感染組和對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡25~65歲,性生活史>3年;月經(jīng)干凈3 d以上;取樣前72 h無性生活及陰道用藥;排除標(biāo)準(zhǔn):無性生活史;既往診斷有宮頸病變史;有免疫性疾病、移植、惡性腫瘤放療史;子宮已切除。本研究經(jīng)河南省漯河市漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),所有研究對象知情并均簽署知情同意書。
1.2方法
1.2.1現(xiàn)場調(diào)查 采用專門設(shè)計的調(diào)查表對研究對象進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查,內(nèi)容包括年齡、種族、初產(chǎn)年齡、孕次和產(chǎn)次等方面情況。
1.2.2HPV檢測方法 采用專用HPV采樣器采集宮頸HPV標(biāo)本。按照15種型別HPV測試劑盒(江蘇中生方政生物技術(shù)股份有限公司)說明書,對15種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)DNA行半定量檢測。陰性者為對照組,陽性者為高危HPV感染組。
1.2.3DNA提取 抽取外周靜脈血5 ml,乙二胺四乙酸(Elhylene dia mine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,-80℃保存。按照TaKaRa全血DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)操作進(jìn)行。
1.2.4引物設(shè)計 引物序列由武漢生物工程公司合成。見表1。
表1 設(shè)計引物Tab.1 Primer Design
1.2.5基因多態(tài)性檢測 在聚合酶鏈反應(yīng)(Polym-erase chain reaction,PCR)儀(ABI-9700,天津金思德生物科技有限公司)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),PCR擴(kuò)增體系為20 μl,DNA模板2 μl(30 ng/μl),2×PCR Taq Mix 10 μl(TaKaRa),正反向引物各0.5 μl(10 μm/μl),ddH2O 7 μl(日本TaKaRa Bio 株式會社)。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min,98℃變性5 s,退火30 s,退火溫度分別為56℃、60℃,72℃延伸40 s,共30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-31BN,北京六一生物科技有限公司)檢測結(jié)果。PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物公司,應(yīng)用Sanger測序法對TAP1-637和LMP7-145單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測。
2.1研究對象基本情況 兩組在年齡、種族、初產(chǎn)年齡、孕次和產(chǎn)次等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 研究對象基本情況Tab.2 Basic dates of research object
2.2Hardy Weinberg平衡檢驗 經(jīng)吻合度檢驗TAP1-637、LMP7-145兩位點(diǎn)的基因型分布在各組均符合Hardy Weinberg平衡定律(感染組:P=0.245,對照組:P=0.351;感染組:P=0.817,對照組:P=0.792),表示所選取的樣本具有群體代表性,即所選取的樣本能夠代表河南省漯河市農(nóng)村婦女的基因型分布。
2.3TAP1-637、LMP7-145多態(tài)性位點(diǎn)基因型 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為405 bp、351 bp,其電泳圖及多態(tài)位點(diǎn)測序結(jié)果見圖1、2。
圖1 TAP1-637、LMP7-145擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:M.DNA Maker;Lane 1-8.The PCR products of locus TAP1-637 was 405 bp;Lane 9-16.The PCR products of locus LMP7-145 was 351 bp.
圖2 TAP1-637、LMP7-145基因位點(diǎn)測序圖Fig.2 Direct sequencing graph of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:The arrow pointed to the polymorphism of locus rs TAP1-637 and LMP7-145.①.TAP1-637 genotype AA;②.TAP1-637 genotype AG;③.TAP1-637 genotype GG;④.LMP7-145 genotype GG;⑤.LMP7-145 genotype GT;⑥.LMP7-145 genotype TT.
2.4TAP1-637等位基因和基因型頻率 TAP1-637位點(diǎn)的A、G等位基因的頻率在對照組和感染組中分別為82.2%、17.8% 和82.1%、17.9%,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);AA、AG、GG基因型頻率分布在對照組(65.8%、32.9%和1.3%)和感染組(65.5%、33.3%和1.2%)間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
表3 漯河市農(nóng)村婦女TAP/LMP基因多態(tài)性分布情況Tab.3 Comparison of polymorphism distribution of locus TAP/LMP gene in in rural women in Luohe city
2.5LMP7-145等位基因和基因型頻率 LMP7-145位點(diǎn)的G、T等位基因的頻率在對照組和感染組中分別為82.7%、17.3% 和82.9%、17.1%,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);GG、GT、TT基因型頻率分布在對照組(67.5%、30.3%和2.2%)和感染組(68.2%、29.5%和2.3%)間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
2.6TAP1-637和LMP7-145位點(diǎn)單倍型分析 Haploview軟件進(jìn)行聯(lián)合分析,結(jié)果顯示存在連鎖不平衡現(xiàn)象(D′=1.0,r2=0.5),見圖3。TAP1-637、LMP7-145的單倍型分析結(jié)果顯示,對照組中單倍型GA頻率為64.4%,GG為17.7%,TA為17.9%。與GA單倍型相比,GG、TA單倍型均與高危HPV感染風(fēng)險無關(guān)(P>0.05)。見表4。
圖3 TAP1-637、LMP7-145位點(diǎn)連鎖不平衡分析Fig.3 Association between locus TAP1-637 gene and LMP7-145 detected by linkage disequilib-rium analysis
表4 TAP1-637、LMP7-145位點(diǎn)單倍型在對照組和感染組的比較Tab.4 Comparison of genotype of locus TAP1-637 and LMP7-145 gene in cervical high-risk HPV infection group and healthy control
高危HPV感染是宮頸癌及癌前病變的主要病因,且具有明顯的區(qū)域性[7],本研究選擇漯河市農(nóng)村婦女為研究對象,農(nóng)村居住地人口相對穩(wěn)定,少與外界通婚,流動性小,人群間生活方式及遺傳背景較一致,能更好地突出地域性特點(diǎn)。另外,大量的研究表明機(jī)體是否發(fā)生HPV感染與環(huán)境、生活方式、免疫、遺傳背景密切相關(guān)[8-10],而目前免疫遺傳因素是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[11],因此本研究從免疫遺傳學(xué)角度出發(fā),探討宮頸高危HPV感染的可能易感因素。
人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)即人類主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC),作為機(jī)體的免疫遺傳背景,在控制病毒的感染、腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過程中起著重要的作用。在MHC-Ⅱ類區(qū)域內(nèi)存在低分子量蛋白酶體(LMP)和抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)兩類重要基因。LMP可將內(nèi)源性抗原肽進(jìn)行降解,產(chǎn)生合適的C-端氨基酸殘基肽段,TAP可將肽段轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中,與HLAⅠ類分子結(jié)合,形成穩(wěn)定的HLA-Ag復(fù)合物然后呈遞到細(xì)胞表面被特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識別,產(chǎn)生特定的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因而LMP和TAP被認(rèn)為是調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素。而LMP和TAP的多態(tài)性可使機(jī)體對內(nèi)源性抗原肽有不同的識別力、親和力和轉(zhuǎn)運(yùn)力,最終機(jī)體對內(nèi)源性抗原肽免疫應(yīng)答結(jié)果不同,免疫耐受、免疫保護(hù)或自身免疫。已有大量研究顯示,LMP和TAP基因多態(tài)性和HBV感染、HCV感染有關(guān)[12-14]。但目前對LMP和TAP基因多態(tài)性與高危HPV感染研究報道較少。
基于以上思路,并考慮到基因多態(tài)性具有區(qū)域性特點(diǎn),本研究在抗原呈遞通路相關(guān)基因中選取了TAP1-637和LMP7-145兩個多態(tài)性位點(diǎn),首次對河南省漯河市農(nóng)村婦女高危HPV感染人群及健康人群進(jìn)行基因多態(tài)性檢測,并進(jìn)行易感性關(guān)聯(lián)分析。基因多態(tài)性結(jié)果分析顯示,TAP1-637和LMP7-145等位基因和基因型頻率在高危HPV感染組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明TAP1-637和LMP7-145的基因多態(tài)性對個體是否會高危HPV感染可能無影響。為了進(jìn)一步的探討TAP1-637和LMP7-145基因多態(tài)性和高危HPV易感性的關(guān)系,本研究構(gòu)建并分析了LMP/TAP單倍型,發(fā)現(xiàn)單倍體型在感染組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,進(jìn)一步說明TAP1-637和LMP7-145的基因多態(tài)性可能和高危HPV易感性無關(guān)。
綜上所述,我們首次研究發(fā)現(xiàn)TAP1-637和LMP7-145的基因多態(tài)性與河南省漯河市農(nóng)村婦女高危HPV感染可能不具有相關(guān)性。這種結(jié)果,可能是由于本研究納入病例數(shù)相對較少引起。 亦有可能是TAP1-637和LMP7-145對高危HPV感染的影響并非通過遺傳因素或單核苷酸基因多態(tài)性產(chǎn)生,也不排除與TAP、LMP基因其他位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)等。因此,TAP1-637和LMP7-145位點(diǎn)與漯河地區(qū)農(nóng)村婦女宮頸高危HPV感染之間是否有關(guān)聯(lián)性,需要大樣本、多中心研究研究,進(jìn)一步確定。