NLRP3、PYCARD、CASP1在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者中的變化特點(diǎn)及其臨床意義①

張志明 齊張旸 徐叢榮 黃青青 趙鐘文 吳寬裕 陳煜宇 王亮萍 吳方真

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，福州 350003)

痛風(fēng)是一種尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)滑膜、滑囊、軟骨及其他組織引起的晶體相關(guān)性疾病，以反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎、皮下痛風(fēng)石、痛風(fēng)性腎病、尿路結(jié)石為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。本病好發(fā)于40～50歲中年男性，是最常見(jiàn)的炎癥性關(guān)節(jié)炎，我國(guó)的患病率約為 1.1%?；颊叨嘣谝归g發(fā)病，病損部位可出現(xiàn)紅、腫、熱和壓痛感，還會(huì)伴隨全身無(wú)力、發(fā)熱、頭痛等癥狀[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(CASP1)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(PYCARD)均與炎癥反應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)[2]。研究選取我院確診的90例GA患者(GA組)及健康體檢志愿者(對(duì)照組)，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平，分析各指標(biāo)與GA患者血清炎癥因子之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取我院2016年2月至2017年4月確診的90例GA患者(GA組)、選取健康體檢志愿者90例(對(duì)照組)。GA組，年齡36～78歲，平均(57.5±13.0)歲，男79例、女11例，體重指數(shù)(BMI)(22.6±2.4)kg/m2，其中急性GA患者60例(AGA組)、非急性期GA患者30例(NAGA組)。對(duì)照組，年齡33～79歲，平均(58.0±15.2)歲，男75例、女15例，體重指數(shù)(BMI)(22.4±2.8)kg/m2。兩組研究對(duì)象的年齡、性別、BMI比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.237、P=0.813，χ2=0.719、P=0.396，t=0.514、P=0.608)。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①GA患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②患者年齡范圍19～79歲；③對(duì)照組為體檢健康志愿者；④本研究獲得患者本人的知情同意，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①惡性腫瘤；②血液系統(tǒng)疾?。虎郯橛袊?yán)重的精神疾病、認(rèn)知功能障礙；④免疫功能缺陷；⑤腦血管疾病；⑥甲狀腺功能疾病；⑦心肌梗死、心衰、心瓣膜疾病等；⑧嚴(yán)重的肝腎功能疾病。

1.1.4口服藥物 秋水仙堿片(生產(chǎn)企業(yè)：西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技術(shù) 兩組患者均取外周靜脈血3 ml，立即置入含有肝素鈉的抗凝管中。將外周血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)菌分離，用Trizol試劑(生產(chǎn)廠家：Invitrogen 公司)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA，加入30 μl無(wú)RNA酶水溶解RNA，在取5 μl RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在瓊脂糖凝膠圖譜中顯示28S、18S、5S 三條帶，計(jì)算 A260/A280，只采用比值范圍在1.8～2.0者。cDNA的合成則嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)操作，所選參數(shù)為37℃ 15 min，85℃ 5 s 終止反應(yīng)。將產(chǎn)物cDNA在-20℃條件下保存，作備用。

以對(duì)照組和GA組的cDNA建立25 μl的反應(yīng)體系，對(duì)此進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠中加入Green-View核酸染料，后將瓊脂糖凝膠用FUSION-Fx5曝光機(jī)進(jìn)行曝光拍攝，曝光機(jī)由北京五洲東方科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。對(duì)曝光所得的PCR目的條帶圖進(jìn)行灰度值測(cè)定，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)量由NLRP3、PYCARD、CASP1灰度值比內(nèi)參灰度值表示。

1.2.2血清炎癥因子檢測(cè) 檢測(cè)AGA組、NAGA組患者的血清IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

患者抽取靜脈血3 ml，將得到的血液立即放入含促凝劑的試管中，靜置30 min，離心3 min，取適量血清對(duì)IL-6、TNF-α進(jìn)行測(cè)定，兩種指標(biāo)均采用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，IL-6 ELISA試劑盒來(lái)自上海百蕊生物科技有限公司，TNF-α ELISA試劑盒則來(lái)自上海基免實(shí)業(yè)有限公司，上述操作樣按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3治療方法 依據(jù)2016年中國(guó)痛風(fēng)診療指南治療患者[4]，在低嘌呤飲食、足量飲水前提下，急性發(fā)作期在癥狀出現(xiàn) 12 h內(nèi)服用秋水仙堿片(劑量1 mg，1 h后服用0.5 mg)和 (或)非甾體類抗炎藥 (NSAIDs)( 如果需要加用質(zhì)子泵抑制劑)，口服糖皮質(zhì)激素 ( 潑尼松 30～35 mg/d 使用 3～5 d) 或抽取關(guān)節(jié)液并注射糖皮質(zhì)激素，具體治療方案根據(jù)患者病情個(gè)性化調(diào)整。非急性期根據(jù)患者病情，繼續(xù)逐漸降低血尿酸水平，減少血尿酸突然大幅度波動(dòng)，防止痛風(fēng)石形成，終生維持患者血尿酸水平<360 μmol/L，對(duì)于嚴(yán)重痛風(fēng)患者血尿酸水平<300 μmol/L。采用小劑量別嘌呤醇開(kāi)始，以100 mg/d開(kāi)始，每2～4周加量100 mg，以達(dá)到目標(biāo)水平，且注意治療過(guò)程中尿酸監(jiān)測(cè)，配合預(yù)防治療，囑避免高嘌呤飲食。

2 結(jié)果

2.1治療前GA組和對(duì)照組的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較 GA組患者治療前的NLRP3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，GA組患者的PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 GA組和對(duì)照組的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2治療前不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較 治療前不同GA組患者比較，AGA組患者的NLRP3、CASP1 mRNA表達(dá)水平高于NAGA組(P<0.05)，而PYCARD mRNA差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較

2.3治療前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較 GA組患者的治療后的NLRP3 mRNA水平顯著升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CASP1 mRNA、PYCARD mRNA表達(dá)水平在治療后顯著降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 治療前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平比較

2.4治療前不同病情GA患者炎癥 指標(biāo)水平比較 AGA組患者的IL-6表達(dá)水平低于NAGA組(P<0.05)，而TNF-α差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同病情GA患者炎癥指標(biāo)水平比較

2.5GA患者治療前炎癥指標(biāo)與NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性 治療前，GA組患者的NLRP3 mRNA 與IL-6、TNF-α呈負(fù)相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；PYCARD、CASP1 mRNA與GA患者的IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表5。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果Tab.5 Correlation analysis results

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病因主要是體內(nèi)尿酸過(guò)多，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在嘌呤代謝障礙，該過(guò)程導(dǎo)致嘌呤的最終代謝產(chǎn)物尿酸增高，血中尿酸濃度高于正常值，醫(yī)學(xué)上稱為“高尿酸血癥”[1]。當(dāng)血中尿酸濃度超過(guò)飽和溶解度時(shí)就會(huì)析出成為結(jié)晶體，在軟組織或關(guān)節(jié)中積存，使身體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎也與飲食、天氣變化及外傷等多方面的因素密切相關(guān)[4]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者可能會(huì)出現(xiàn)痛風(fēng)石、整個(gè)關(guān)節(jié)呈暗紅色、高尿酸血癥、非對(duì)稱性關(guān)節(jié)腫痛等現(xiàn)象[5,6]。常用治療方式主要為藥物治療，急性期患者可選用非甾體抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，緩解期主要以抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄為目的使用藥物，無(wú)癥狀高尿酸血癥的治療主要包括減肥、控制血脂、減少非必要的利尿劑應(yīng)用、控制飲食等[4]。

NLRP3的基因多態(tài)性與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)狀態(tài)、遺傳易感性及藥物治療效果均有密切關(guān)系，主要起到調(diào)控CASP1 的作用，NLRP3 與CASP1 可形成NLRP3炎癥體，發(fā)揮調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用[7-9]。CASP1 主要通過(guò)多條信號(hào)通路參與細(xì)胞炎癥及凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與死亡的平衡[10]。PYCARD是炎癥復(fù)合體中重要的接頭分子蛋白，主要是通過(guò)自身的寡聚化來(lái)集中上游受體蛋白和下游炎癥相關(guān)蛋白，進(jìn)而形成一個(gè)炎癥復(fù)合體[11]。PYCARD與炎癥相關(guān)的CASP1 所組合成的復(fù)合物，在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用，此外PYCARD還參與了NLRP3炎癥復(fù)合體的形成[12]。目前，NLRP3 mRNA水平在治療前后的變化尚有爭(zhēng)議，有文獻(xiàn)報(bào)道治療后NLRP3 mRNA水平顯著降低，亦有學(xué)者報(bào)道治療后NLRP3 mRNA水平較治療前顯著升高[7,13]。我們的研究證實(shí)，GA組患者治療后NLRP3 mRNA水平顯著升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與部分學(xué)者報(bào)道的結(jié)果一致[5,7]。目前關(guān)于造成上述結(jié)果的原因尚不清楚，可能與患者的具體診療方案有關(guān)，亦可能與NLRP3基因多態(tài)性存在一定聯(lián)系，但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。另外，本研究證明，CASP1、PYCARD mRNA表達(dá)水平在治療后顯著降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明經(jīng)過(guò)治療后GA組患者痛風(fēng)改善與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)下降存在一定關(guān)系，但炎癥反應(yīng)與痛風(fēng)改善之間的因果關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

GA組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，而PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，該結(jié)果提示NLRP3基因表達(dá)在炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)負(fù)性調(diào)節(jié)效果，而PYCARD、CASP1可能在GA發(fā)病起中發(fā)揮促進(jìn)作用。 AGA組患者的NLRP3、CASP1 mRNA表達(dá)水平高于NAGA組，而PYCARD mRNA差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示通過(guò)檢測(cè)NLRP3、PYCARD、CASP1的表達(dá)可能有助于判斷GA的分類，選擇最佳治療藥物與用藥療程。

單核巨噬系統(tǒng)在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(AGA)發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，此階段涉及IL-6、TNF-α等多種炎癥因子，在發(fā)病過(guò)程中患者體內(nèi)的IL-6水平上升，進(jìn)入機(jī)體循環(huán)中，機(jī)體呈現(xiàn)全身急性時(shí)相反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)發(fā)熱、身體不適等現(xiàn)象[14]。TNF-α具有主導(dǎo)炎癥因子的作用，對(duì)炎癥因子具有促進(jìn)效果[15]。AGA組患者的IL-6、TNF-α表達(dá)水平高于NAGA組，該結(jié)果說(shuō)明IL-6、TNF-α在AGA發(fā)病密切相關(guān)。GA組患者的NLRP3 mRNA 與IL-6、TNF-α呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，PYCARD、CASP1 mRNA與GA患者的IL-6、TNF-α呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，即各指標(biāo)之間均存在密切聯(lián)系，在臨床中可通過(guò)結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)GA的病情進(jìn)行判斷，也提示我們PYCARD、CASP1的表達(dá)在GA各種炎癥因子的釋放和成熟過(guò)程中的重要性。

綜上所述，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平變化與GA患者病情變化及炎癥反應(yīng)程度之間存在密切關(guān)聯(lián)。通過(guò)檢測(cè)NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)有助于評(píng)估患者病情，指導(dǎo)后續(xù)治療。通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達(dá)水平可能是GA治療的新靶點(diǎn)。