Notch信號(hào)通路參與龍生蛭膠囊的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用

秦 詠 王 瑩

(山東省胸科醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 250013)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，是一種導(dǎo)致斑塊發(fā)展和冠狀動(dòng)脈進(jìn)行性狹窄的炎癥性疾病[1]。當(dāng)人體內(nèi)脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，引起局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致AS發(fā)生[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路可調(diào)控血管新生，且阻斷Notch配體可減輕代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化[3,4]。龍生蛭膠囊是由黃芪、水蛭、川芎等12味藥組成的復(fù)合制劑，具有補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)的功效，在臨床上聯(lián)合其他藥物對(duì)腦梗及氣虛血瘀型腦梗死患者有較好的治療效果[5,6]。龍生蛭膠囊可降低血脂，抑制炎癥反應(yīng)，但其作用的具體機(jī)制尚未闡述清楚[5,7]。因此，本次研究通過高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建AS大鼠模型，探討龍生蛭膠囊是否通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路對(duì)AS大鼠產(chǎn)生治療作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 無特定病原體(Specific pathogen Free,SPF)級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010。

1.1.2主要試劑 總膽固醇(Total cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)及一氧化氮(NO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒均購自武漢華美生物有限公司；CD31抗體購自BD公司；兔抗活性Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，NICD)多克隆抗體和兔抗Hes1多克隆抗體均購自Abcam公司；GAPDH購自Sigma公司；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光試劑均購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型構(gòu)建[8]SD大鼠60只隨機(jī)分為6組：正常組(N)、模型組(AS)、龍生蛭膠囊低劑量組(LSZ-LD)、龍生蛭膠囊中劑量組(LSZ-MD)、龍生蛭膠囊高劑量組(LSZ-HD)和辛伐他汀組(Simvastatin)，每組10只。除正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)外，其他五組大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)和一次性腹腔注射維生素D3(70萬U/kg)。高脂飼料配方：80.8%基礎(chǔ)飼料、3.5%膽固醇、10%煉制豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖。4周后開始灌胃給藥處理，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，低劑量組大鼠給予0.75 g/kg龍生蛭膠囊灌胃，中劑量組給予1.5 g/kg龍生蛭膠囊灌胃，高劑量組給予3.0 g/kg龍生蛭膠囊灌胃，辛伐他汀組給予5.0 mg/kg辛伐他汀灌胃，1 d/次。8周后，開始取材并檢測(cè)。

1.2.2取材 給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食過夜。用戊巴比妥(30 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，打開大鼠腹腔進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，于-80℃中保存。分離并剪下1 cm的胸主動(dòng)脈，置于4%多聚甲醛中固定，待檢。

1.2.3生化及ELISA檢測(cè)指標(biāo) 將取出的腹主動(dòng)脈血靜置后離心分離出血清，然后根據(jù)試劑盒說明操作，采用比色法測(cè)定大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C及NO水平。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的TNF-α和IL-6含量。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量 取出外周血并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度后將細(xì)胞接種于96孔板中，1.5×103細(xì)胞/孔。加入5 μl CD31抗體，混勻后避光孵育30 min。PBS洗滌3次，離心收集細(xì)胞。PBS重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察形態(tài)學(xué)變化 取出固定的胸主動(dòng)脈組織于包埋盒中進(jìn)行脫水浸蠟包埋，然后切成厚度為4～5 μm的切片。脫蠟后行蘇木素-伊紅染色，梯度乙醇進(jìn)行脫水，再用二甲苯透明，最后中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察主動(dòng)脈的形態(tài)變化。

1.2.6Western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 提取主動(dòng)脈組織總蛋白，BCA法蛋白定量后，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入稀釋后的Ⅰ抗(NICD稀釋比：1∶500；Hes1稀釋比：1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次。加入經(jīng)HRP標(biāo)記的Ⅱ 抗后，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，置于暗室中曝光顯影，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察 正常組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮表面光滑，結(jié)構(gòu)完整。模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜出現(xiàn)嚴(yán)重增生，有大量的泡沫細(xì)胞堆積，血管腔狹窄。經(jīng)過不同劑量龍生蛭膠囊處理后主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷得到改善，血管腔擴(kuò)大，且高劑量組最明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖1)。

圖1 主動(dòng)脈HE染色(×100)Fig.1 HE staining of aorta(×100)

2.2龍生蛭膠囊對(duì)血脂水平的影響 生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠血脂水平，結(jié)果如表1所示。與正常組比較，模型組血清中的TC、TG和LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比較，龍生蛭膠囊各劑量處理組的TC、TG和LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，尤其是中劑量和高劑量組的改善效果更顯著(P<0.01)。高劑量組與辛伐他汀組之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 龍生蛭膠囊對(duì)大鼠血脂水平的影響

2.3龍生蛭膠囊對(duì)血清炎癥因子的影響 模型組大鼠血清中的TNF-α和IL-6含量均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而與模型組比較，各劑量給藥組大鼠血清中的TNF-α和IL-6含量顯著降低(P<0.01)，效果最佳的高劑量組與陽性藥物辛伐他汀組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 龍生蛭膠囊對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

2.4龍生蛭膠囊對(duì)血清NO水平及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響 結(jié)果如圖2和表3所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中NO含量顯著降低(P<0.01)，外周血中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，給予龍生蛭膠囊治療的大鼠血清中NO含量出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)。高劑量組和辛伐他汀組間無明顯差異(P>0.05)。

圖2 流式檢測(cè)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Number of circulating endothelial cells was measu-red by flow cytometry

表3 龍生蛭膠囊對(duì)血清NO水平及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響

2.5龍生蛭膠囊對(duì)Notch通路蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠的NICD和Hes1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高與正常組(P<0.01)。而經(jīng)過不同劑量龍生蛭膠囊治療后，AS大鼠模型的NICD和Hes1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)。NICD和Hes1在高劑量組和辛伐他汀組中表達(dá)量無明顯差異。結(jié)果見圖3。

圖3 龍生蛭膠囊對(duì)NICD、Hes1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Longshengzhi capsule on proteins expression of NICD and Hes1Note:N.Normal group.Compared with the normal group,**.P<0.01;compared with the AS group,#.P<0.05,##.P<0.01.

3 討論

AS的典型特征是動(dòng)脈中形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，即斑塊，而斑塊是在脂質(zhì)代謝和免疫應(yīng)答紊亂的背景下，由炎癥反應(yīng)支持而成，具有限制血流、血栓閉塞及破裂的傾向[9]。大量研究表明，血脂異常、高血壓及肥胖是AS的早期干預(yù)危險(xiǎn)因素[10,11]。且LDL-C、TC和TG水平升高易導(dǎo)致血管壁脂質(zhì)沉積而形成斑塊。因此，調(diào)節(jié)血脂是治療AS的主要方法之一。而HDL具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能，可抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的自我修復(fù)[12]。在本研究中，龍生蛭膠囊可顯著降低AS大鼠模型血清中的TC、TG及LDL-C含量，并升高HDL-C水平，發(fā)揮了明顯的降脂作用。進(jìn)一步檢測(cè)了血清中TNF-α和IL-6含量，結(jié)果顯示龍生蛭膠囊可顯著減低TNF-α和IL-6水平。提示龍生蛭膠囊具有降低血脂，抗血管炎癥的功能。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，與早期AS發(fā)病的機(jī)制相關(guān)[13]。Gimbrone等[14]也闡述了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙會(huì)影響凝血和血栓形成、局部血管張力和氧化還原平衡以及急性和慢性炎癥反應(yīng)之間的協(xié)調(diào)，是AS病變起始和進(jìn)展中的關(guān)鍵因素[14]。NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放，具有擴(kuò)張血管，抑制血小板黏附、聚集等功能，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙時(shí)導(dǎo)致NO合成減少或通路障礙，從而促進(jìn)了AS的發(fā)病過程[15]。正常人體內(nèi)的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量是極少的，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量便會(huì)增多，是反映血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物[16,17]。本次研究結(jié)果也顯示，在AS大鼠模型血清中的NO含量降低，外周血中的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加，而經(jīng)過龍生蛭膠囊給藥處理后，NO含量升高，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量趨于正常，提示龍生蛭膠囊可改善AS大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞功能。

Notch信號(hào)通路是在進(jìn)化過程中高度保守的一類通路，由受體、配體及效應(yīng)物組成，不同的配體與不同的受體結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)的Notch信號(hào)所產(chǎn)生的生物學(xué)效用不同[18]。當(dāng)受體胞外區(qū)和配體結(jié)合被激活后，胞內(nèi)區(qū)釋放出具有活性的NICD，NICD與重組信號(hào)蛋白結(jié)合后進(jìn)一步激活下游靶基因Hes[19-21]。據(jù)報(bào)道，Notch信號(hào)通路參與了心血管疾病的炎癥反應(yīng)，從而推動(dòng)了心血管疾病的病理過程[22]。Binesh等[19]的研究結(jié)果顯示抑制NICD和下游靶基因Hes表達(dá)，即抑制了Notch信號(hào)通路可發(fā)揮抗AS的作用。鑒于Notch信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)及AS病理中的作用，本研究中對(duì)AS大鼠模型主動(dòng)脈血管組織中的NICD和Hes1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)龍生蛭膠囊可有效地抑制AS大鼠模型的NICD和Hes1蛋白表達(dá)。

綜上所述，龍生蛭膠囊可降低AS大鼠模型的血脂水平，發(fā)揮抗血管炎癥反應(yīng)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，其抗AS的作用機(jī)制可能與抑制Notch信號(hào)通路有關(guān)。另外，在本次研究的HE染色結(jié)果中，龍生蛭膠囊高劑量組的作用效果稍差于辛伐他汀組，而Notch信號(hào)通路蛋白表達(dá)、炎性細(xì)胞因子及NO的水平與辛伐他汀組的差異并不明顯，推測(cè)陽性藥物辛伐他汀治療AS的主要作用機(jī)制可能不是通過調(diào)控炎性細(xì)胞因子、NO等水平實(shí)現(xiàn)的。