Poly I：C刺激對(duì)裸鼴鼠和小鼠巨噬細(xì)胞PKR/eIF2α信號(hào)通路影響的比較研究

林麗芳, 張成財(cái), 李 煜, 張倩倩, 陳 超, 李壘辰, 楊文靜, 李 莉, 崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室, 上海200433)

裸鼴鼠屬于掘地動(dòng)物，其生活的洞穴環(huán)境陰暗潮濕, 通風(fēng)條件不良, 易滋生各種有害微生物。但裸鼴鼠在這種極端環(huán)境中壽命能長(zhǎng)達(dá)30年以上,是同等體型嚙齒類動(dòng)物的10倍左右[1,2], 有研究[3,4]證實(shí)與小鼠比較，裸鼴鼠細(xì)胞對(duì)很多有害物質(zhì)(如百草枯、高溫、重金屬、DNA損傷劑、有害異物等)具有更強(qiáng)的抗性。這提示裸鼴鼠在長(zhǎng)期的進(jìn)化中演變出較強(qiáng)的抗疾病損傷能力。因此, 本課題組前期通過(guò)聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C)刺激裸鼴鼠后，檢測(cè)裸鼴鼠腸道組織的病理變化、炎癥因子表達(dá)、自噬標(biāo)志蛋白—微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B (microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，裸鼴鼠具有一定的抗Poly I：C刺激能力[5]?；谠搶?shí)驗(yàn)結(jié)果, 課題組使用Poly I：C干預(yù)裸鼴鼠和小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞，研究Poly I：C的效應(yīng)蛋白雙鏈RNA依賴性蛋白激酶R(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)及其下游因子真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, EIF2α)表達(dá), 以期為裸鼴鼠的抗 Poly I：C刺激機(jī)制研究提供分子生物學(xué)參考依據(jù)。

巨噬細(xì)胞由單核細(xì)胞移行到各個(gè)組織分化成熟而形成，是一種具有強(qiáng)大吞噬功能的免疫輔佐細(xì)胞，在機(jī)體正常生理過(guò)程和病理過(guò)程中發(fā)揮重要功能。巨噬細(xì)胞能夠吞噬細(xì)菌、病毒、凋亡細(xì)胞、抗原抗體復(fù)合物等[6,7]； 具有較強(qiáng)的抗原處理和遞呈能力[8]； 分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[9,10]。其中，抗病毒能力是巨噬細(xì)胞最為重要的功能之一，是病毒感染后作用于病毒的主要吞噬細(xì)胞。因此，本研究使用巨噬細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

PKR作為病毒產(chǎn)物雙鏈RNA的直接效應(yīng)蛋白，在抗病毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。首先能夠產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)機(jī)體的抗病毒作用。其次通過(guò)磷酸化下游因子EIF-2α而阻斷病毒蛋白的復(fù)制。最后PKR能通過(guò)激活Fas(一種跨膜蛋白)通路，來(lái)激活下游的Caspase-8誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞走向凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究裸鼴鼠巨噬細(xì)胞的PKR/eIF2α信號(hào)通路在Poly I：C刺激中發(fā)揮的作用，以期為裸鼴鼠抗病毒功能研究提供可靠的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠8只，6～8周齡，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2017-0002]； 10～12月齡裸鼴鼠8只，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施內(nèi)。

1.2 儀器及試劑

主要儀器有：低溫高速離心機(jī)、垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、三氣培養(yǎng)箱等。

主要試劑有：Poly I：C、2-AP、M-CSF均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEM(低糖、高糖)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Anti-PKR抗體(ab184257)、Anti-PKR (phospho T446)抗體(ab32036)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司； Phospho-eIF2α(Ser51) (D9G8) XP?Rabbit mAb 抗體(3398S)、eIF2α 抗體(9722S)購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司；Caspase 8抗體(13423-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.3.1 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng) 每只小鼠使用2 mL體積分?jǐn)?shù)0.75%戊巴比妥鈉腹腔注射過(guò)量麻醉處死，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，無(wú)菌環(huán)境中分離小鼠的后肢股骨和脛骨；先剝離皮膚和肌肉，去除兩端的結(jié)締組織，暴露骨髓腔，用1 mL注射器輕輕插入骨髓腔，用完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制成單細(xì)胞懸液； 離心后棄上清，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基終止裂解，離心后棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃, 5% CO2培養(yǎng) 8～12 h； 收集上清, 離心后棄上清，用含60 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)的高糖DMEM(15%胎牛血清)重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%飽和度時(shí)進(jìn)入干預(yù)階段。

1.3.2 裸鼴鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng) 每只裸鼴鼠使用2 mL體積分?jǐn)?shù)0.75%戊巴比妥鈉腹腔注射過(guò)量麻醉處死，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡2～3 min, 移入超凈臺(tái)，無(wú)菌條件下取其兩后肢，剝離皮膚和肌肉，分離股骨和脛骨，去掉兩端軟骨組織；1 mL注射器輕輕插入骨髓腔，用完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制成單細(xì)胞懸液。離心后棄上清, 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，35℃，3%O2，5%CO2及 92%N2條件下培養(yǎng)8～12 h； 收集上清, 離心后棄上清，用含60 ng/mL M-CSF的低糖DMEM(15%胎牛血清)重懸細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征。待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%飽和度時(shí)進(jìn)入干預(yù)階段。

1.4 Poly I：C 刺激對(duì)裸鼴鼠PKR及其信號(hào)通路的影響

1.4.1 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的Poly I：C刺激及PKR活性的抑制 分別將裸鼴鼠和小鼠的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞分成對(duì)照組、Poly I：C給藥組、Poly I：C+氨基嘌呤(2-AP)給藥組、2-AP給藥組。Poly I：C給藥組加入終濃度10 μg/mL的Poly I：C；對(duì)照組加入同等體積的PBS溶液；Poly I：C+2-AP給藥組加入終濃度為10 μg/mL的Poly I：C后培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入終濃度5 mmol/L的2-AP；2-AP給藥組加入終濃度5 mmol/L的2-AP，30 min后分別收集細(xì)胞蛋白，進(jìn)行下一步的檢測(cè)。

1.4.2 PKR活性抑制后PKR信號(hào)通路表達(dá)情況檢測(cè) 分別提取裸鼴鼠和小鼠細(xì)胞的對(duì)照組、Poly I：C 給藥組、Poly I：C+2-AP、2-AP 給藥組總蛋白，加熱變性后，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后一抗、二抗孵育，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，Kodak Gel Logic 4000 R成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)。分別檢測(cè)Poly I：C給藥及PKR活性抑制后，細(xì)胞的Caspase-8和PKR-eIF2α信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔΔC方法對(duì)RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)用±s表示，使用SPSS22.0(SPSS Inc., IL,USA)通過(guò)One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Poly I：C給藥、PKR活性抑制后巨噬細(xì)胞PKR的表達(dá)

Poly I：C給藥后，小鼠巨噬細(xì)胞的PKR磷酸化水平顯著降低(P＜0.01，圖1)，而裸鼴鼠則顯著升高(P＜0.01，圖2)，表明Poly I：C能抑制小鼠的PKR活性，而裸鼴鼠則相反，其PKR活性被顯著激活。

ctl： 對(duì)照組； 2-AP： 2-AP 給藥組； poly+2-AP： poly I： C 和 2-AP 給藥組； poly： poly I： C 給藥組； ★ P＜0.05, ★★ P＜0.01； 下圖同圖1 小鼠巨噬細(xì)胞Pho-PKR蛋白表達(dá)水平

圖2 裸鼴鼠巨噬細(xì)胞Pho-PKR蛋白表達(dá)水平

2.2 EIF2α的表達(dá)

單獨(dú)使用2-AP抑制PKR活性后, 小鼠巨噬細(xì)胞的EIF2α磷酸化水平顯著降低(P＜0.01，圖3)，但裸鼴鼠巨噬細(xì)胞的EIF2α磷酸化水平則顯著升高。同時(shí) Poly I：C 給藥后加入 2-AP, 與 Poly I：C單獨(dú)給藥組比較，裸鼴鼠細(xì)胞中，2-AP對(duì)EIF2α的抑制作用尤其顯著，基本無(wú)蛋白表達(dá)(圖4)。

2.3 Caspase-8的表達(dá)

Caspase-8蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5、圖6, poly I：C給藥后, 無(wú)論是小鼠還是裸鼴鼠巨噬細(xì)胞, Caspase-8蛋白表達(dá)都顯著升高(P＜0.01), 表明細(xì)胞的凋亡水平增強(qiáng)。通過(guò)2-AP抑制PKR活性后, 裸鼴鼠細(xì)胞的Caspase-8蛋白表達(dá)水平顯著下降, 表明裸鼴鼠細(xì)胞中PKR活性對(duì)Caspase-8表達(dá)有促進(jìn)作用。

3 討論

圖3 小鼠巨噬細(xì)胞Pho-EIF2α蛋白表達(dá)水平

圖4 裸鼴鼠巨噬細(xì)胞Pho-EIF2α蛋白表達(dá)水平

圖5 小鼠巨噬細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)水平

圖6 裸鼴鼠巨噬細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)水平

Poly I：C能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠、大鼠血漿的白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平上升[11,12]； 誘導(dǎo)小鼠下丘腦的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β) mRNA水平上升；可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)部分細(xì)胞的凋亡[11,12]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[5]結(jié)果表明，Poly I：C能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的病理學(xué)改變，包括腸道組織腺體廣泛性充血，腸組織細(xì)胞出現(xiàn)大量的空泡狀線粒體，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等，而裸鼴鼠除了腸組織細(xì)胞中出現(xiàn)線粒體增多，變長(zhǎng)，自噬體增多外，未表現(xiàn)出顯著的病理學(xué)變化。由前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，裸鼴鼠具有一定的抗Poly I：C刺激能力。而PKR是一種存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能被雙鏈RNA激活，激活后，進(jìn)一步促使真核翻譯啟始因子EIF-2α磷酸化，抑制蛋白合成且同時(shí)促進(jìn)多種凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)分化中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Poly I：C給藥后，小鼠巨噬細(xì)胞的PKR和EIF2α磷酸化水平顯著降低, 而裸鼴鼠則顯著升高, 表明Poly I：C能抑制小鼠的PKR活性，而裸鼴鼠的PKR活性被顯著激活。目前的研究[13,14]報(bào)道顯示，低濃度的雙鏈RNA能活化PKR，而高濃度的雙鏈RNA卻抑制PKR的活化。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一濃度的Poly I：C給藥，對(duì)裸鼴鼠細(xì)胞是低濃度，而對(duì)小鼠細(xì)胞卻是高濃度，該現(xiàn)象表明裸鼴鼠細(xì)胞對(duì)Poly I：C刺激具有較高的抗性。

PKR活化后能通過(guò)磷酸化EIF-2α抑制蛋白合成，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)使用Poly I：C干預(yù)后通過(guò)2-AP抑制PKR活性，結(jié)果顯示，2-AP給藥后下調(diào)了小鼠和裸鼴鼠PKR和磷酸化PKR的表達(dá)，尤其是裸鼴鼠的PKR，2-AP給藥后顯著地抑制PKR的表達(dá)。單獨(dú)2-AP給藥后小鼠巨噬細(xì)胞的活性PKR和活性EIF2α比例顯著下降，裸鼴鼠巨噬細(xì)胞的活性PKR比例也顯著下降?？梢?jiàn)，裸鼴鼠細(xì)胞的PKR對(duì)2-AP的敏感性更強(qiáng)。2-AP是一種強(qiáng)誘變堿基，可抑制PKR的磷酸化，從而阻斷其下游效應(yīng)分子的激活。

PKR引發(fā)的凋亡是通過(guò)與筋膜相關(guān)的死亡域蛋白 (Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)/Caspase-8實(shí)現(xiàn)的。Caspase-8酶原復(fù)合物在死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物中通過(guò)自身切割而被激活，進(jìn)而切割執(zhí)行者Caspase-3酶原，產(chǎn)生有活性的Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，poly I：C給藥后，無(wú)論是小鼠還是裸鼴鼠巨噬細(xì)胞，裂變的Caspase-8蛋白表達(dá)都顯著升高(P＜0.01), 表明細(xì)胞的凋亡水平增強(qiáng)。通過(guò)2-AP抑制PKR活性后，裸鼴鼠細(xì)胞的Caspase-8蛋白表達(dá)水平顯著下降，但小鼠細(xì)胞卻無(wú)顯著差異，該結(jié)果表明裸鼴鼠細(xì)胞中PKR活性對(duì)Caspase-8表達(dá)有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與小鼠比較，無(wú)論是Poly I：C還是2-AP的刺激，裸鼴鼠細(xì)胞的PKR/EIF2α和PKR/Caspase-8信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用都比小鼠敏感，對(duì)外界的刺激具有較快的調(diào)節(jié)能力。