裸鼴鼠與小鼠抗輻射能力比較研究

陳 超, 叢 薇, 楊文靜, 崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)教研室, 上海 200433)

1980年代，裸鼴鼠被發(fā)現(xiàn)是一種奇特的真社會性哺乳動物，其終生在離地約2 m的地下洞穴生活，幾乎完全喪失了視覺，僅依靠身體兩側(cè)的觸須來辨認方向；雖屬哺乳動物，卻又類似冷血動物通過與環(huán)境的熱交換來調(diào)節(jié)體溫。裸鼴鼠擁有長達30年以上的壽命，同時還能在低氧、高二氧化碳濃度的地下環(huán)境中生活，對癌癥具有超級免疫力[1-3]。電離輻射廣泛存在于自然界中，具有波長短、頻率高、能量高等特點，如機體暴露于輻照條件下，接受照射超過一定劑量會導(dǎo)致組織中分子和原子之間的化學(xué)鍵被破壞，從而對機體重要的生化結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生嚴重影響，造成急慢性輻照損傷、輻照誘變和輻照致癌[4]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)已將電離輻射(所有類型)列入一類致癌物清單。60Co放射源的應(yīng)用非常廣泛，如：輻射育種、食品輻照保藏與保鮮、無損探傷、輻射消毒、腫瘤的放射治療等。其產(chǎn)生的γ射線能破壞細胞中的DNA和RNA，使受損的DNA和RNA發(fā)生降解，失去合成蛋白質(zhì)和遺傳功能，從而對機體造成損傷[5]。為了探討實驗室馴化的裸鼴鼠對電離輻射的耐受性，本課題組利用不同劑量和不同照射頻率60Coγ射線分別對裸鼴鼠和小鼠及兩者的皮膚成纖維細胞進行輻照，觀察兩種動物的生存及病理變化，直觀、系統(tǒng)地觀察到裸鼴鼠抗電離輻射的現(xiàn)象，為進一步研究其抗電離輻射機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

52周齡雄性裸鼴鼠，由本實驗室自行繁殖(第6世代)飼養(yǎng)； 8周齡雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-016]。動物均飼養(yǎng)在屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0004]。裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠原代皮膚成纖維細胞按照本實驗室前期方法分離培養(yǎng)[6]。

1.2 主要儀器及試劑

細胞培養(yǎng)箱購自新加坡Esco公司，流式細胞儀購自美國BD公司，DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶購自美國Gibco公司；I型膠原酶購自美國Sigma公司；熒光標(biāo)記流式用抗體購自美國Biolegend公司；小鼠IgG干粉購自索萊寶公司；活性氧(ROS)測定試劑盒購自南京建成生物。60Coγ線全身照射由海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 6 Gy一次性全身輻照對裸鼴鼠的影響60Co γ線6 Gy分別一次性全身照射裸鼴鼠和小鼠，輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照后觀察動物的大體狀態(tài)。記錄輻照后30 d內(nèi)動物的死亡情況，計算死亡率。流式細胞術(shù)檢測動物0 d、2 d、3 d、4 d外周血中的輔助性T淋巴細胞和殺傷性淋巴細胞比值(CD4+/CD8+)； 流式細胞術(shù)每周(0～4 周)檢測動物外周血中的樹突狀細胞(dendritic cells, DC)百分比。裸鼴鼠組10只；小鼠組ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均為雄性。

1.3.2 低劑量多次全身輻照裸鼴鼠的病理觀察60Coγ線1.75 Gy分別全身分次照射裸鼴鼠和小鼠，每周照射1次，共4次，累積劑量為7.0 Gy，輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照期間觀察動物的大體狀態(tài)。10個月后安死術(shù)處死動物, 觀察胸腺、脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、骨髓等組織臟器變化情況, 并進行組織切片觀察。裸鼴鼠組10只；小鼠組ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均為雄性。

1.3.3 裸鼴鼠及C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞輻照后的氧損傷測定 裸鼴鼠與C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞分別接種6孔細胞培養(yǎng)板, 每種細胞3個復(fù)孔, 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行60Coγ線輻照, 輻照劑量為6 Gy和50 Gy, 輻照劑量率0.88 Gy/min。輻照后正常培養(yǎng)24 h，去除細胞培養(yǎng)液, 加入稀釋好的2’, 7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)覆蓋細胞。DCFH-DA稀釋方法：以1∶1 000的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋活性氧(ROS)測定試劑盒中的DCFH-DA，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L。37 ℃體細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，去除DCFH-DA溶液，PBS洗細胞，用0.25%的胰酶消化細胞5 min，加入含血清的培養(yǎng)基中和反應(yīng)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s的形式表示，組間差異比較采用ANOVA分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 Gy一次性全身輻照對裸鼴鼠的影響

6 Gy60Coγ射線一次性輻照活體動物，輻照后第3日起，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)飲食和活動減少，毛發(fā)蓬松，精神萎靡等狀態(tài)，而裸鼴鼠生命活動正常。裸鼴鼠30 d存活率能夠達到100%, 而小鼠只有30%(圖1A)。通過T淋巴細胞亞群檢測發(fā)現(xiàn),輻照后2 d的CD4+/CD8+出現(xiàn)明顯升高, 在輻照后4 d升高更為顯著； 小鼠CD4+/CD8+則無顯著變化(圖1B)。裸鼴鼠輻照后1 d外周血DC細胞即有明顯升高, 輻照后7 d雖略有回降, 卻仍保持較本底略高的水平, 而14 d裸鼴鼠外周血DC細胞水平升高近7倍； 小鼠外周血DC細胞水平變化則相對較小(圖1C)。所有小鼠組數(shù)據(jù)均為ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠合計統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.2 低劑量多次全身輻照裸鼴鼠的病理觀察

少量多次輻照后裸鼴鼠和小鼠飲食和精神狀態(tài)都比較正常。在觀察后期(6個月后)，部分小鼠開始消瘦，毛發(fā)蓬松，不愛活動； 裸鼴鼠無異常表現(xiàn)。少量多次輻照后小鼠骨組織以骨髓腔內(nèi)紅骨髓(有造血功能)的減少為主要病變；裸鼴鼠的骨組織呈現(xiàn)輕微的纖維化，骨髓腔內(nèi)的細胞成分無異常。小鼠的胸腺、肝脾有不同程度的腫大，腸黏膜上皮大范圍脫落、缺失，腸腔中可見脫落的上皮細胞。裸鼴鼠腸黏膜各級結(jié)構(gòu)完整，腸上皮細胞數(shù)量豐富、排列整齊，未見明顯異常。其中裸鼴鼠的胸腺存在比較明顯的退化，故病理圖中無裸鼴鼠胸腺染色圖(圖2)。

圖2 少量多次輻照后動物組織病理學(xué)觀察(HE×400)

圖1 60Coγ射線一次性6 Gy全身輻照對裸鼴鼠的影響

2.3 輻照后裸鼴鼠皮膚成纖維細胞的氧損傷測定

裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠的皮膚成纖維細胞在6 Gy劑量輻照24 h后細胞ROS含量無顯著變化。而50 Gy劑量輻照24 h后，皮膚成纖維細胞的ROS含量顯著增加，裸鼴鼠皮膚成纖維細胞升高了近5倍，C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞則升高了將近50倍(表1)。

表1 輻照后24 h裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞ROS含量

3 討論

最新研究[7]表明，裸鼴鼠較小鼠有更強的免疫反饋能力，其去除大塊病變的效率是小鼠的2～3倍，去除尿嘧啶的效率是1.5～3倍，切割A(yù)P位點的效率比小鼠細胞高約1.4倍。CD4+T淋巴細胞可以激活CD8+T淋巴細胞，確保建立并維持細胞毒性作用[8]。CD8+T淋巴細胞可以抑制抗體合成及T淋巴細胞增殖過程，兩者之間存在平衡關(guān)系，也是維持體液免疫與細胞免疫重要的調(diào)節(jié)者，對于保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[9]。兩者比值升高提示機體細胞免疫處在活躍狀態(tài)，而比值降低則提示機體處于免疫抑制狀態(tài)[10]。本研究結(jié)果表明，裸鼴鼠在6Gy劑量一次性輻照后，CD4+/CD8+比值顯著升高，而小鼠無明顯變化，表明裸鼴鼠具有比小鼠更高效的免疫反饋系統(tǒng)，與以往研究結(jié)果一致，這可能是裸鼴鼠抗輻射特性產(chǎn)生的重要原因。

DC是目前已知的最有效的抗原呈遞細胞和唯一具有激活靜息性T淋巴能力的抗原遞呈細胞，而其強大的抗原呈遞功能在機體的免疫應(yīng)答(特別是初次免疫應(yīng)答)中扮演著重要的角色[11]。本研究結(jié)果表明，輻照后裸鼴鼠DC水平明顯升高，而小鼠無明顯變化，這表明裸鼴鼠擁有比小鼠更高的免疫應(yīng)答水平，這可能也是裸鼴鼠抗輻射特性產(chǎn)生的重要原因。

輻射會誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生ROS，ROS會攻擊生物膜上磷脂中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)[12,13]。正常皮膚成纖維細胞中有比較完善的氧化與抗氧化系統(tǒng)，如：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、抗壞血酸、維生素E等，它們可以快速清除細胞內(nèi)的ROS，保持細胞與組織的穩(wěn)定與平衡[14]。本研究分離所得裸鼴鼠和C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞在6 Gy劑量輻照下ROS無顯著變化，說明兩者具有正常皮膚成纖維細胞的抗氧化系統(tǒng)；在50 Gy劑量輻照下，C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞ROS升高倍數(shù)比裸鼴鼠皮膚成纖維細胞ROS升高倍數(shù)更顯著，這說明裸鼴鼠皮膚成纖維細胞受到的氧損傷比C57BL/6J小鼠皮膚成纖維細胞低得多，證明裸鼴鼠皮膚成纖維細胞同樣具有卓越的抗輻射特性。

綜上所述，裸鼴鼠在活體水平擁有卓越的抗輻射特性，這可能是由于其擁有良好的免疫應(yīng)答和免疫反饋系統(tǒng)。裸鼴鼠皮膚成纖維細胞擁有比小鼠皮膚成纖維細胞更良好的抗輻射特性。本文研究結(jié)果為進一步研究裸鼴鼠抗電離輻射機制提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。