斑馬魚甲狀腺腫大病例分析

李英娘, 戴 瑋, 盛 健

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 杭州 310000)

斑馬魚作為模式生物有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如早期胚胎透明，體外受精發(fā)育等便于我們實(shí)時(shí)觀察其發(fā)育變化。2018年10月在武漢召開的第四屆全國(guó)暨全球華人斑馬魚Principle Investigator(PI)大會(huì)有來(lái)自不同國(guó)家、地區(qū)的260多位代表參會(huì)。從中看出越來(lái)越多的研究學(xué)者把斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?。健康的斑馬魚是保證科學(xué)研究的基礎(chǔ)，但目前國(guó)內(nèi)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的斑馬魚飼養(yǎng)管理辦法，并且關(guān)于斑馬魚疾病的研究也相對(duì)較少。

2017年5月份作者所在的斑馬魚實(shí)驗(yàn)室發(fā)生了較大規(guī)模的斑馬魚甲狀腺腫大現(xiàn)象。甲狀腺腫大在人群中也是一個(gè)比較常見(jiàn)的疾病，人類的甲狀腺腫大主要是由于缺碘或者碘過(guò)量引起的，中國(guó)從1995年開始，強(qiáng)制實(shí)行食用鹽加碘，國(guó)民的碘營(yíng)養(yǎng)不良狀況明顯得到改善[1]。碘與甲狀腺炎的發(fā)病密切相關(guān)[2]。甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中常見(jiàn)的惡性腫瘤[3]，碘的攝入量不當(dāng)也會(huì)引起該疾病，與適碘地區(qū)相比，分化型甲狀腺癌多發(fā)生在水源性高碘地區(qū)[4]。本文將進(jìn)一步研究斑馬魚甲狀腺腫大的病因，通過(guò)HE染色和透射電子顯微鏡觀察病變組織，同時(shí)設(shè)計(jì)了有碘和無(wú)碘飼養(yǎng)組，并分析甲狀腺相關(guān)基因的表達(dá)差異，為今后該疾病的治療和預(yù)防提供一些科學(xué)依據(jù)及候選模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病魚的特征 病魚來(lái)源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院斑馬魚平臺(tái)，成魚的養(yǎng)殖密度是15～20尾/3 L 的養(yǎng)殖缸，品系是AB。肉眼能觀察到病魚甲狀腺腫大，不同個(gè)體腫大程度有差異，但患病的魚能正常游動(dòng)，正常攝食，也能正常產(chǎn)卵。

1.1.2 儀器和試劑 斑馬魚養(yǎng)殖單元(上海海圣生物技術(shù)有限公司)，全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信科技公司), 體視熒光顯微鏡(Nikon SMZ18)，正置熒光顯微鏡(Nikon ni)，熒光定量PCR儀(羅氏 480II)，透射電子顯微鏡(FEI tecnai 10)。

SYBR Premix和提取RNA的試劑盒(南京諾唯贊生物公司)，豐年蟲卵(天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司)，海鹽(浙江藍(lán)海星鹽制品有限公司)，片狀混合飼料(廣東江門海豚飼料)，其他試劑均由國(guó)藥生產(chǎn)。

圖1 甲狀腺腫大病魚

1.2 飼養(yǎng)條件

斑馬魚的養(yǎng)殖系統(tǒng)水都是經(jīng)過(guò)去離子純水儀處理的自來(lái)水。養(yǎng)殖系統(tǒng)里會(huì)自動(dòng)加入適量的分析純氯化鈉和分析純碳酸氫鈉, 系統(tǒng)的pH值7.2～7.4, 電導(dǎo)率 485～510 μs/cm, 水溫 28～29 ℃，光暗時(shí)間： 14 h∶10 h。每日早晚飼喂孵化好的豐年蟲2次，孵化豐年蟲使用分析純氯化鈉和分析純碳酸氫鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色 固定組織： 先用1 mg/mL Tricaine溶液將患有甲狀腺腫大的斑馬魚麻醉猝死, 隨后整條魚放入10 mL的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定7 d。再通過(guò)包埋、切片、染色。HE染色可以將細(xì)胞核染為紫藍(lán)色, 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)染為紅色。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察 冷凍猝死患病斑馬魚, 在顯微鏡下取下突起的紅色病變組織(甲狀腺),用1 mL 體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛PBS緩沖液4 ℃固定超過(guò)1個(gè)月。再通過(guò)包埋、超薄切片、染色。

1.3.3 檢測(cè)使用分析純氯化鈉和海鹽養(yǎng)殖水內(nèi)碘含量 分別收集使用分析純氯化鈉養(yǎng)殖的循環(huán)水500 mL，和海鹽養(yǎng)殖的循環(huán)水500 mL。收好的樣品放在-20 ℃貯存。樣品送青島斯八達(dá)分析測(cè)試有限公司檢測(cè)，檢測(cè)水體里碘元素的濃度。

1.3.4 有碘和無(wú)碘飼養(yǎng) 有碘組養(yǎng)殖水：直接從海圣循環(huán)養(yǎng)殖單元中取出，養(yǎng)殖單元中系統(tǒng)自動(dòng)加入適量的海鹽和碳酸氫鈉，電導(dǎo)率控制在490～510 μs/cm，pH 值控制在7.2～7.4。

無(wú)碘組養(yǎng)殖水： 10 L的純水(分析純氯化鈉35 g、碳酸氫鈉2 g、氯化鈣 1 g、氯化鉀0.5 g)。

1.3.5 熒光定量PCR法檢測(cè)基因表達(dá)差異

1.3.5.1 提取RNA 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)挑選受精后7 d (7dpf) 50尾作為一組，挑選60 dpf 的5尾作為一組。先加入1 mg/mL Tricaine將魚猝死，隨后加入裂解液,并用全自動(dòng)樣品快速研磨儀震動(dòng)40 s使斑馬魚組織完全裂解，然后用試劑盒提取RNA。

1.3.5.2 甲狀腺相關(guān)基因的表達(dá) 具體檢測(cè)基因及序列如表1。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚甲狀腺組織HE染色

正常情況下斑馬魚的甲狀腺組織是彌散分布的，圖中空泡較大的區(qū)域都是甲狀腺。如圖2所示甲狀腺(A)彌散分布在斑馬魚頭部,并且可以觀察到甲狀腺濾泡(D)腫大的現(xiàn)象。

2.2 透射電子顯微鏡鏡觀察

正常核仁比較圓潤(rùn)，正常線粒體內(nèi)部分布了很多的線粒體嵴?；加屑谞钕倌[大的病魚，其核仁形態(tài)異常，線粒體腫大且自溶，細(xì)胞已經(jīng)有調(diào)亡的趨勢(shì)，如圖3所示。

2.3 分別檢測(cè)使用分析純氯化鈉和海鹽的養(yǎng)殖水內(nèi)碘含量

使用分析純氯化鈉養(yǎng)殖的循環(huán)水碘的濃度小于方法檢出限, 海鹽養(yǎng)殖的循環(huán)水碘濃度為7.87 μg/L。

表1 甲狀腺素相關(guān)基因引物序列[5]Table 1 Primer sequences for thyroid hormone gene

圖2 斑馬魚甲狀腺組織HE染色觀察圖

圖3 斑馬魚甲狀腺組織透射電子顯微鏡觀察

2.4 甲狀腺相關(guān)基因的Ct值

兩種飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)7 dpf的小魚對(duì)比，檢測(cè)的5個(gè)基因，只有CRF基因表達(dá)有差異，無(wú)碘組表達(dá)量低于有碘組(P＜0.05)。兩種飼養(yǎng)條件下，60 dpf的小魚對(duì)比，5個(gè)基因的表達(dá)都無(wú)差異。同一飼養(yǎng)條件下，不同日齡小魚的基因表達(dá)量有差異，詳見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO基因相對(duì)表達(dá)量的差異

CRF能調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成。促甲狀腺素β(TSHβ)是一種垂體激素, 能促進(jìn)甲狀腺合成甲狀腺素(T4)[6]。鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)可以將碘轉(zhuǎn)運(yùn)到甲狀腺濾泡細(xì)胞里面[7,8]。甲狀腺球蛋白(TG)的數(shù)量能直接反應(yīng)甲狀腺功能是否正常。甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)是甲狀腺激素合成的一種酶, 可以將碘化離子氧化成碘[9]。本實(shí)驗(yàn)無(wú)碘條件下飼養(yǎng)7 dpf斑馬魚,CRF基因的表達(dá)量明顯低于有碘組,CRF的表達(dá)量降低會(huì)引起促甲狀腺激素分泌減少，表明碘對(duì)CRF基因的表達(dá)可能有調(diào)控作用。

表2 比較CRF、TSHβ、NIS、TG、TPO相對(duì)表達(dá)量的Ct值和P值

3.2 線粒體腫大和甲狀腺腫大的關(guān)系

線粒體腫大在很多疾病中常被提到，過(guò)量的服用鐵和大量的飲用酒精都會(huì)導(dǎo)致線粒體腫大[10],注射內(nèi)毒素也會(huì)觀察到肝臟線粒體腫大[11]。線粒體功能的異常也會(huì)導(dǎo)致很多的疾病，例如耳聾、心臟病、帕金森病、癌癥等[19]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞損傷時(shí)線粒體腫大是比較常發(fā)生的，腫大的線粒體會(huì)出現(xiàn)線粒體基質(zhì)變淺，有些嵴甚至消失。內(nèi)共生假說(shuō)認(rèn)為，線粒體的形成是原核細(xì)胞吞噬了好氧細(xì)菌，兩者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的互作關(guān)系，形成一個(gè)共生體[12]。本實(shí)驗(yàn)室甲狀腺腫大的斑馬魚數(shù)量逐漸增多以后，通過(guò)調(diào)整飼養(yǎng)條件，一個(gè)月后甲狀腺腫大大部分都消失，在斑馬魚身上的甲狀腺腫大是可逆的。線粒體相比于其他的細(xì)胞器，是一個(gè)比較獨(dú)立的細(xì)胞器，當(dāng)機(jī)體內(nèi)發(fā)生不利于線粒體生存的條件時(shí)，它們能快速做出響應(yīng)。線粒體腫大和甲狀腺腫大是如何發(fā)生的，它們之間存在什么關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 緩解斑馬魚甲狀腺腫大的方法

首先把養(yǎng)殖系統(tǒng)里使用的分析純氯化鈉換成海鹽，海鹽里含有多種微量元素更加有利于斑馬魚的健康。發(fā)病前斑馬魚養(yǎng)殖水體的溫度是28～29 ℃； 發(fā)病以后我們將溫度調(diào)低, 水溫控制在26～27 ℃。發(fā)病前每日是投喂2餐孵化好的豐年蟲, 發(fā)病以后改為1餐豐年蟲, 1餐片狀混合飼料。

3.4 人類甲狀腺腫大的模型價(jià)值

缺碘或者碘攝入過(guò)多都會(huì)引起甲狀腺疾病，缺碘情況下甲狀腺激素的合成不足，促甲狀腺激素會(huì)增多，會(huì)導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞的過(guò)度增生，表現(xiàn)為甲狀腺腫大[12,13]。甲狀腺腫大是一種對(duì)慢性碘缺乏癥的生理適應(yīng)[14]。斑馬魚缺碘出現(xiàn)甲狀腺腫大與人類缺碘引起的“大脖子病”有同樣的機(jī)制及表型，是人類大脖子病的潛在模型。

3.5 推行標(biāo)準(zhǔn)化斑馬魚飼養(yǎng)管理制度

2013年第一部實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)(DB11 /T 1053-2013)包括了：養(yǎng)殖水中微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)[15]、養(yǎng)殖水中寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、遺傳質(zhì)量控制[16]、配合飼料技術(shù)要求、飼養(yǎng)環(huán)境條件和病理診斷規(guī)范”六個(gè)部分。但標(biāo)準(zhǔn)中未涉及到碘含量，而根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺乏碘會(huì)導(dǎo)致斑馬魚甲狀腺腫大，威脅到斑馬魚健康，所以在飼養(yǎng)斑馬魚時(shí)需使用有碘鹽，以保證斑馬魚健康。

(感謝洪曉黎、張璐文、王貝貝、謝恩軍、劉麗、何旭艷、尹文林、潘魯湲等在課題開展過(guò)程中給予的指導(dǎo)和幫助。)