裸鼴鼠海馬神經(jīng)元純化模型建立及其低氧耐受特性機(jī)制的初步研究

楊文靜, 李 煜, 馮 延, 李壘辰, 許月榕, 劉 攀, 林麗芳, 孫 偉, 崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室, 上海 200433)

裸鼴鼠分布于非洲肯尼亞、埃塞俄比亞、索馬里等地區(qū)，隸屬于嚙齒目。雖然早在19世紀(jì)中期，裸鼴鼠就被發(fā)現(xiàn)和命名，但其在生物醫(yī)學(xué)方面研究的優(yōu)越性引起科學(xué)家的關(guān)注是在1980年代之后。裸鼴鼠終生生活于黑暗的地下環(huán)境，這導(dǎo)致其視覺發(fā)生嚴(yán)重退化，以至于完全喪失，所以它是研究神經(jīng)退行性病變的理想動(dòng)物模型[1]。裸鼴鼠長期生活于氧含量極低、二氧化碳含量極高的環(huán)境，所以對(duì)低氧環(huán)境具有極強(qiáng)的耐受能力,是研究缺氧相關(guān)疾病的天然動(dòng)物模型[2]。另外，裸鼴鼠的壽命可以長達(dá)30年以上，是同體型嚙齒類動(dòng)物10倍左右，所以其可以作為研究抵御慢性衰老癥和衰老性病理變化的天然理想動(dòng)物模型[3]。同時(shí)，在裸鼴鼠整個(gè)生命過程中均未發(fā)生腫瘤，其對(duì)癌癥具有超強(qiáng)的免疫力，其可能為人類攻克癌癥這一醫(yī)學(xué)難題提供一些重要的線索[4,5]。所以，裸鼴鼠作為一種具備諸多優(yōu)勢生物學(xué)特性的新型模式動(dòng)物資源，正逐漸成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。在裸鼴鼠越來越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的同時(shí)，其具備的諸多優(yōu)勢生理學(xué)特征急需進(jìn)一步闡明。

急性分離的裸鼴鼠海馬切片在低氧或者遭受營養(yǎng)剝奪時(shí), 卻存在一些獨(dú)特的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[6,7]，一個(gè)主要的特點(diǎn)就是裸鼴鼠海馬在低氧情況下Ca2+波動(dòng)幅度顯著降低，這就極大降低了恢復(fù)常氧濃度時(shí)因鈣超載帶來的細(xì)胞凋亡風(fēng)險(xiǎn)[4]。由此可見，對(duì)于裸鼴鼠這些特殊生理學(xué)特性的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究尚處于起步階段, 具體的組織、細(xì)胞及分子學(xué)機(jī)制亟待進(jìn)一步深入揭示。以裸鼴鼠低氧耐受的生物學(xué)機(jī)制為例, 目前雖有國外學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的海馬腦片經(jīng)歷低氧時(shí)沒有出現(xiàn)顯著的Ca2+超載現(xiàn)象，但是離體培養(yǎng)的腦片包含的細(xì)胞成分較為復(fù)雜，低氧刺激的情況下無法排除其他類型的神經(jīng)細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞等是否也發(fā)揮了一定的作用。所以，為了進(jìn)一步證實(shí)，我們必須利用純化培養(yǎng)的裸鼴鼠神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步觀察和研究，而目前我們尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外學(xué)者成功建立出裸鼴鼠神經(jīng)細(xì)胞體外純化培養(yǎng)的細(xì)胞模型。因此，本研究期望建立裸鼴鼠海馬神經(jīng)元的體外純化培養(yǎng)方法，并初步探討其耐低氧特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

妊娠60～65 d的清潔級(jí)封閉群裸鼴鼠由海軍軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室提供。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州金燕凈化設(shè)備廠)、三氣培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2.2 主要試劑 DNA酶購自中國Solarbio生物科技有限公司；神經(jīng)生長因子(NGF)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、胰蛋白酶、左旋多聚賴氨酸、青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)等均購自美國Sigma公司；DMEM、低糖DMEM、澳洲來源胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基、B27無血清添加因子等均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司、CCK8檢測試劑盒均購自中國碧云天公司。一抗：神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)抗體購自中國Proteintech 公司。二抗： 綠色熒光抗體購自美國Jackson公司。Trizol試劑和SYBGreenI購自美國TaKaRa公司。

混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基成分為低糖DMEM培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，海馬神經(jīng)元純化培養(yǎng)基為Neurobasal+2%B27+10 μmol/L 5-Fu。海馬神經(jīng)元維持培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)為2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基, 同時(shí)添加100 ng/ml NGF，Trizol購自美國TaKaRa公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，2×SYBR Green I購自美國TaKaRa公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元純化模型建立 裸鼴鼠海馬混合神經(jīng)細(xì)胞的收集：將裸鼴鼠在CO2中作窒息處理后立即浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中進(jìn)行消毒，然后將其置于無菌玻璃平皿中，并用含青鏈霉素混合液擦拭裸鼴鼠腹部皮膚，小心剖腹并將其含有胎鼠的子宮完整取出，剪開子宮膜并小心取出胎鼠。將胎鼠顱骨剪開，于體式顯微鏡下將左右大腦從正中線分成兩半，然后小心剝離海馬，并剝除海馬表面的腦膜結(jié)構(gòu)。用顯微剪將海馬組織剪碎至1 mm3，加入組織消化液混勻之后，于37 ℃消化15 min。然后用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，離心去除上清之后，在神經(jīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)基中將沉淀重懸并吹打成單細(xì)胞懸液。隨后將單細(xì)胞懸液種于無菌的且預(yù)先包被有基質(zhì)層的24孔板中。

裸鼴鼠大腦海馬混合神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)：將上述得到的細(xì)胞，用神經(jīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱(5%CO2、10%O2、96%飽和濕度、35 ℃)中培養(yǎng)12 h，待其完全貼壁之后，換為神經(jīng)元純化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基2 d，如此為一個(gè)周期，培養(yǎng)一周。

1.3.2 細(xì)胞鑒定 培養(yǎng)在8室細(xì)胞培養(yǎng)皿中的裸鼴鼠神經(jīng)元細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，PBS洗一次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液于室溫(25 ℃左右)條件下固定15 min, PBS洗滌3次后用10%羊血清于室溫封閉1h, 加入抗NeuN抗體(與PBS按1∶100的比例稀釋)于4 ℃孵育過夜(12 h以上)。次日，PBS潤洗3次后加入熒光二抗(與PBS按1∶100的比例稀釋)室溫孵育2 h(避光)，PBS潤洗3次后加入Hoechst33342(與PBS按1∶1 000的比例稀釋)室溫孵育5 min(避光)，PBS潤洗3次，利用Leica熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝(避光)。

1.3.3 海馬神經(jīng)元的低氧耐受能力檢測 海馬神經(jīng)元按104/mL按每孔100 μL的體積種于96孔板中, 于5%CO2、8%O2、96%飽和濕度、35℃三氣培養(yǎng)箱中脈沖培養(yǎng)并觀察8～9 d，常氧組氧濃度為21%，低氧組氧濃度為8%(下同)； 檢測前小心吸出培養(yǎng)基，PBS潤洗3次后, 每孔加入10 μL CCK-8溶液和100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。每次平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。然后利用分光光度計(jì)在450 nm處測定吸光度(A)值。

1.3.4 低氧環(huán)境下海馬神經(jīng)元軸突生長情況分析海馬神經(jīng)元按104/mL按每孔100 μL的體積種于8室培養(yǎng)皿中，于5%CO2、8%O2、96%飽和濕度、35 ℃三氣培養(yǎng)箱中脈沖培養(yǎng)并觀察8～9 d。進(jìn)行終止培養(yǎng)前4 d將細(xì)胞分別于常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)，然后利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞后，于光學(xué)顯微鏡下觀察軸突生長情況，利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行長度分析。

1.3.5 QPCR檢測海馬神經(jīng)元中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)水平 培養(yǎng)于常氧和低氧條件下的海馬神經(jīng)元(同上)，Trizol法于無RNA酶條件下提取RNA，SYBGreenI進(jìn)行檢測。熱循環(huán)條件： 95℃3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體積 10 μL： NRase Free dH2O 3 μL，SYBGreenI 5 μL，DNA 模板 1 μL，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔。采用比較Ct值(2-△△Ct)相對(duì)定量，改變的倍數(shù)(fold change)=2-△△Ct：△Ct=Ct靶基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct處理組-△Ct未處理組。以actin為對(duì)照。以2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。HIF1α引物：HIF-1α正向 5'-GAGGTGGATATGTCTGGGTTG -3'，反向 5'- AGGGAGAAAATCAAGTCGTGC -3',actin引物正向5'-TGGAGAAAGCGGCCAAATAC-3'，反向 5'-AAAGGTGGAAGAGTGGGTG-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征

光學(xué)顯微鏡下，裸鼴鼠皮層神經(jīng)元胞體較大，具有1個(gè)或數(shù)個(gè)較短的樹突，另一端具有一個(gè)細(xì)長的軸突(圖1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下的裸鼴鼠海馬神經(jīng)元

2.2 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果如圖2所示，在無血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞能夠保持NeuN陽性(綠色熒光)。裸鼴鼠神經(jīng)元具備典型的皮層神經(jīng)元形態(tài)，胞體較大，具有1個(gè)或數(shù)個(gè)較短的樹突，另一端具有一個(gè)細(xì)長的軸突，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示其呈NeuN陽性。所培養(yǎng)裸鼴鼠海馬神經(jīng)元(307.67/310)純度達(dá)99%。

圖2 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元免疫熒光染色

2.3 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元低氧耐受特性

低氧處理4～48 h，裸鼴鼠海馬神經(jīng)與的存活率均高于常氧對(duì)照組(P＜0.05)(圖3)。

低氧處理后海馬神經(jīng)元軸突長度[(56±9) μm]是常氧環(huán)境下[(33±6) μm]的2倍左右(P＜0.05)(圖 4)。

圖3 CCK8檢測裸鼴鼠海馬神經(jīng)元在低氧環(huán)境中存活情況

低氧情況下裸鼴鼠海馬神經(jīng)元中HIF1α的表達(dá)水平(相對(duì)數(shù)值1.0)是常氧時(shí)(相對(duì)數(shù)值3.2±0.5)的3 倍以上(P＜0.05)。

圖4 低氧及常氧時(shí)裸鼴鼠神經(jīng)元軸突生長情況示意圖

3 討論

海馬在機(jī)體多種功能中發(fā)揮著舉足輕重的作用，特別是記憶的采集與整合、學(xué)習(xí)能力的獲得以及空間導(dǎo)航等過程中[9,10]。多種神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中出現(xiàn)的疾病都在一定程度上與海馬的結(jié)構(gòu)及功能異常有這一定程度的聯(lián)系，并且海馬結(jié)構(gòu)和功能的異?？赡茏罱K會(huì)加劇神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。以中風(fēng)為例，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，每年中風(fēng)可導(dǎo)致670 萬人死亡，已經(jīng)躍居世界范圍內(nèi)致殘及致死性疾病的首位，而缺血性中風(fēng)位居第二[11]。目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)低氧耐受機(jī)制尚未被徹底闡明，旨在疏通腦血管的溶栓療法及外科手術(shù)治療等常規(guī)療法只能在血液供應(yīng)上進(jìn)行改善，但是無法從源頭上遏制神經(jīng)元的死亡[11]，并且容易帶來其他潛在的風(fēng)險(xiǎn)。裸鼴鼠特殊的低氧耐受能力恰可作為天然的動(dòng)物模型[7,8]，對(duì)于人類相應(yīng)的疾病機(jī)制以及治療策略的研究意義重大。挖掘裸鼴鼠海馬神經(jīng)元抗缺血缺氧損傷的特性及機(jī)制用于治療靶標(biāo)的篩選，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性損傷疾病的攻克有著至關(guān)重要的意義。

本研究綜合使用多種培養(yǎng)基從裸鼴鼠胎鼠海馬分離并純化培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，摸索出了適于變溫的嚙齒類哺乳動(dòng)物裸鼴鼠海馬神經(jīng)元的合理培養(yǎng)方法，海馬神經(jīng)元的純度能夠達(dá)到98%以上，為深入揭示海馬神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

2011年，中國華大基因聯(lián)合韓國梨花女子大學(xué)對(duì)1只經(jīng)歷7 d低氧處理的雄性裸鼴鼠腦，肝，腎臟基因進(jìn)行了差異表達(dá)測序、并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)低氧條件下表達(dá)顯著上調(diào)或者下調(diào)的基因進(jìn)行了系統(tǒng)的生物功能分類，鑒定出一批可能與低氧適應(yīng)有關(guān)的基因[1]，這也成為我們深入研究裸鼴鼠神經(jīng)系統(tǒng)特殊結(jié)構(gòu)和功能并在細(xì)胞水平闡明其分子機(jī)制的一個(gè)重要橋梁。作為一種與人類基因有著93%相似度的哺乳動(dòng)物[1]，裸鼴鼠這些特殊生理功能的發(fā)現(xiàn)以及機(jī)制探索將為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)[11-15]。裸鼴鼠天然耐低氧的海馬神經(jīng)元模型的建立，可作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的便捷研究工具。

本研究通過分析對(duì)低氧及常氧情況下裸鼴鼠海馬神經(jīng)元軸突生長情況及HIF1α的表達(dá)水平分別從功能及基因水平闡述裸鼴鼠海馬神經(jīng)元的低氧耐受特性。在給予低氧刺激時(shí), 裸鼴鼠海馬神經(jīng)元軸突長度顯著長于常氧情況。這與常氧生存的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在顯著的不同。為了更好地進(jìn)行解釋, 本研究進(jìn)一步對(duì)裸鼴鼠海馬神經(jīng)元在低氧時(shí)的基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析。我們比對(duì)了很多基因(未全部展示)，發(fā)現(xiàn)HIF1α在接受低氧刺激時(shí)，表達(dá)水平顯著上調(diào)。初步證實(shí)裸鼴鼠海馬神經(jīng)元HIF1α在低氧情況下高表達(dá)，可能與其低氧耐受特性有直接的關(guān)系。HIF1α是低氧調(diào)控的關(guān)鍵因子, 其表達(dá)水平上調(diào)會(huì)引起細(xì)胞產(chǎn)生一系列低氧耐受的瀑布效應(yīng)[16], 不僅能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)元的存活能力，而且表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上，就是本研究發(fā)現(xiàn)的裸鼴鼠海馬神經(jīng)元軸突長度的顯著增長。神經(jīng)元軸突的長度對(duì)于神經(jīng)元之間建立突觸聯(lián)系，完成神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞有著至關(guān)重要的作用。并且更為重要的是，樹突棘的生長也會(huì)同時(shí)增強(qiáng)，幫助機(jī)體在必要時(shí)隨時(shí)建立新的突觸聯(lián)系[16]。

綜上所述，本研究建立了裸鼴鼠體外海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)方法，并且通過對(duì)裸鼴鼠海馬神經(jīng)元低氧適應(yīng)機(jī)制的初步研究，將為中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性疾病的預(yù)防和治療提供依據(jù)，同時(shí)也將為人類適應(yīng)低氧作業(yè)條件及缺血缺氧性疾病的防治提供借鑒。