Delta阿片受體激活通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路減輕肝硬化大鼠缺血再灌注損傷

劉玨瑩 潘錢玲 殷文淵 王苑 俞衛(wèi)鋒

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院麻醉科（上海200127）

肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷是肝臟外科手術(shù)常見的并發(fā)癥。臨床上為了減少手術(shù)失血量，常阻斷肝臟血流，當(dāng)血流恢復(fù)即再灌注后，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象即IR 損傷［1］。在合并肝硬化的患者肝臟手術(shù)時，肝臟IR 損傷可引起術(shù)后大量肝臟細(xì)胞的壞死和凋亡、殘肝細(xì)胞再生功能的推遲和抑制，嚴(yán)重者會導(dǎo)致肝功能的衰竭［2］。我國肝硬化患者眾多，行肝臟手術(shù)的患者多數(shù)合并肝硬化。因此，研究硬化肝臟圍術(shù)期器官功能保護(hù)，減輕肝硬化IR 損傷，具有十分重要的臨床意義。

很多藥物預(yù)處理［3-4］被應(yīng)用于治療IR 損傷，并且取得相應(yīng)的療效。阿片受體激動劑是肝臟手術(shù)麻醉中常用的鎮(zhèn)痛藥物，如芬太尼、舒芬太尼和嗎啡等。阿片受體主要有3 種亞型：Mu（μ）、Kappa（κ）和Delta（δ）。筆者前期實驗［6］證明阿片受體激動劑嗎啡可以有效地保護(hù)硬化肝臟，減輕IR 損傷［5］。然而這種保護(hù)作用是通過激活哪種阿片受體亞型還未知。肝臟細(xì)胞主要表達(dá)Delta 阿片受體，因此筆者推斷直接激活Delta 阿片受體可以有效地減輕硬化肝臟IR 損傷。為了深入研究Delta受體激活的作用機(jī)制，本研究選擇了對Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activators of transcription 3，STAT3）通路進(jìn)行探索。前期的研究［5］表明，阿片受體激活可以上調(diào)正常大鼠肝臟JAK2、STAT3蛋白磷酸化的表達(dá)。并且JAK2/STAT3 對抑制IR損傷引起的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞再生具有重要的調(diào)節(jié)作用［7］。然而，JAK2/STAT 通路是否介導(dǎo)了Delta 阿片受體對硬化肝臟IR 損傷的作用機(jī)制，需要深入探究。

本研究擬在大鼠肝硬化模型基礎(chǔ)上建立肝臟IR 損傷，分別應(yīng)用Delta 阿片受體特異性激動劑和拮抗劑，研究Delta 阿片受體在肝臟保護(hù)中的作用以及相關(guān)信號通路，為臨床硬化肝臟圍術(shù)期保護(hù)提供可靠的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑32 只無特定病原體（SPF）級8～10 周雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（購于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心），體質(zhì)量為250 ～300 g，自由飲水和活動。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實驗動物飼養(yǎng)管理中心，批號：RJ-2017-07-10。Delta 阿片受體激動劑［DAla2，D-Leu5］enkephalin（DADLE）、Delta 阿片受體拮抗劑Natrindole 以及β-actin、JAK2 和STAT3 抗體購于英國Abcam 公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購于美國R&D Systems 公司。抗兔二抗購于Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝硬化模型制備根據(jù)前期試驗［5］描述制造模型。99%四氯化碳橄欖油溶液（1∶1 稀釋）2 mL/100 g 體質(zhì)量皮下注射，每周2 次，持續(xù)7周。模型動物均經(jīng)組織學(xué)驗證肝硬化的形成。

1.2.2 大鼠肝臟IR 損傷模型制備根據(jù)前期試驗［5］描述制造模型。肝硬化的大鼠在戊巴比妥（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉下，取正中切口，暴露肝臟。夾閉支配右側(cè)肝葉（右葉、尾葉和三角葉）的肝動脈、門靜脈60 min，隨后松開夾子，隨后用3號縫線關(guān)腹。再灌注6 h 后，取大鼠右側(cè)肝葉和血清標(biāo)本。血清置于-80 ℃冰箱保存，肝臟標(biāo)本用液氮迅速冷凍后，亦置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 實驗分組肝硬化大鼠隨機(jī)分為4 組，每組8 只。（1）假手術(shù)組（SHAM 組）：僅進(jìn)行開腹手術(shù)，分離出肝門血管后，不進(jìn)行血管阻斷，觀察后關(guān)腹，盡量使得開關(guān)腹時間和其他組保持一致。（2）對照組（CON 組）：大鼠開腹后，分離肝門血管，用微量注射器下腔靜脈注射生理鹽水500 μL，10 min 后進(jìn)行IR 損傷。（3）Delta 阿片受體激動劑組（DADLE 組）：開腹分離肝門血管后，從下腔靜脈注射Delta 阿片受體激動劑DADLE 5 mg/kg（生理鹽水稀釋至500 μL），10 min 后進(jìn)行IR 損傷。（4）Delta 阿片受體拮抗劑組（NTD 組）：開腹分離肝門血管后，下腔靜脈注射DELTA 阿片受體拮抗劑Natrindole 5 mg/kg（生理鹽水稀釋至500 μL），10 min 后進(jìn)行IR 損傷。

1.2.4 肝細(xì)胞損傷情況血清ALT 和AST 含量根據(jù)ELISA 試劑盒的操作步驟進(jìn)行檢測。

1.2.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)侨~肝臟組織使用多聚甲醛固定，脫水石蠟包埋后切片為5 μm 薄片，蘇木精&尹紅（H&E）染色。在400 ×光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照。結(jié)果用SUZUKI 分級［8］：根據(jù)組織淤血、細(xì)胞氣球樣變以及壞死面積分為5 個等級（0～4 級），沒有組織淤血、氣球樣變和壞死記為0 級；嚴(yán)重組織淤血、嚴(yán)重氣球樣變以及壞死面積超過60%為4 級。

1.2.6 血清TNF-α 和IL-1β 含量測定根據(jù)ELISA 試劑盒說明書的步驟進(jìn)行檢測。

1.2.7 SYBER Green 熒光定量RT-PCR凍存標(biāo)本在Trizol 試劑中超聲乳化，形成組織勻漿，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，建立10 μL 的反應(yīng)體系：SYBER Green 2 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，雙蒸餾水（ddH2O）2.6 μL，cDNA 2 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95 ℃× 30 s；PCR 循環(huán)（40 個循環(huán)）95 ℃× 10 s，60 ℃× 60 s；溶解曲線，95 ℃× 15 s，60 ℃× 60 s，95 ℃× 15 s。引物由生工生物工程（上海）有限公司提供。JAK2 的上游引物為：5′-GGTATTACGCCTGTGTATCAT-3′，下游引 物 為：5′-GGTTGACTCATCTATGTGGAA-3′。STAT3 的上游引物為：5′-CTAGTCGTCCAATCAACATCA-3′，下游引物為5′-GGTACACAGACAAGGAGTAAT-3′。β-actin 上 游 引 物 為：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物為：CCAGTTGGTGGTAACAATGCCATGT-3′。目的基因的mRNA表達(dá)水平以標(biāo)本內(nèi)β-actin 為基準(zhǔn)，計算2-△△CT，比較各組差異。

1.2.8 蛋白印跡法（Western Blot）將適量肝臟組織研磨，超聲乳化，形成組織勻漿，加入蛋白提取液提取。隨后取上清液進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白濃度。蛋白變性后，配膠電泳，轉(zhuǎn)膜后孵育一抗和二抗，曝光顯影，獲得條帶，用Image Lab 分析軟件分析條帶，計算灰度值。以βactin 為內(nèi)參，進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計作圖軟件進(jìn)行圖片繪制和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。多組數(shù)據(jù)結(jié)果使用單因素方差分析，CON 組數(shù)據(jù)和DADLE 組數(shù)據(jù)比較使用t檢驗。數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Delta 阿片受體激活降低血清ALT 和AST 水平再灌注6 h 后，與CON 組相比，DADLE 明顯降低血清ALT［138 ± 33.369）U/Lvs.（267 ± 106.173）U/L，t＝3.728，P＝0.005 5］和AST［（210±102.666）U/Lvs.（374 ± 64.021）U/L，t＝3.384，P＝0.001 8］。然而NTD 組ALT 和AST 含量與CON 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 各組再灌注6 h 后血清ALT 和AST 水平（n=8）Fig.1 Serum ALT and AST levels at 6 h after reperfusion（n=8）

2.2 Delta 阿片受體激活對肝臟組織形態(tài)學(xué)變化的影響和SUZUKI 評分再灌注6 h 后，H&E 染色結(jié)果表示，DADLE 組相比于CON 組，肝小葉相對完整，壞死面積小，組織淤血輕。而CON 組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝竇邊界不清，內(nèi)可見大量紅細(xì)胞淤積，細(xì)胞疏松，有氣泡樣變性以及有大量壞死面積（圖2）。DADLE 組的SUZUKI 評分和CON 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.002 1）。然而NTD 組的肝臟形態(tài)學(xué)改變以及SUZUKI 分級與CON 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.3 Delta 阿片受體激活降低血清TNF-α 和IL-1β 的含量與CON 組相比，DADLE 明顯降低了TNF-α［（15.561 ± 5.12）pg/mLvs.（32.289 ± 9.23）pg/mL，t＝4.483，P＝0.000 5］和IL-1β的含量［（46.444 ± 7.777）pg/mLvs.（68.841 ± 9.225）pg/mL，t＝5.250，P＝0.000 1］。NTD 組合CON 組相比，血清TNF-α 和IL-1β 的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

圖2 各組H&E 染色結(jié)果（×400）Fig.2 Histological changes by H&E staining（×400）

表1 各組SUZUKI 評分（n=8）Tab.1 Comparison of SUZUKI′s scores（n=8）±s

表1 各組SUZUKI 評分（n=8）Tab.1 Comparison of SUZUKI′s scores（n=8）±s

注：與CON 組相比，*P ＜0.05

組別SHAM 組CON 組DADLE 組NTD 組F 值SUZUKI 評分3.00±0.894*7.67±0.816 4.83±1.169*6.00±0.753 22.74

2.4Delta 阿片受體激活上調(diào) JAK2 和STAT3mRNA 的表達(dá)DALDE 組JAK2 和STAT3 mRNA 的表達(dá)明顯高于CON 組，分別為［（2.686 ±0.410）vs.（1.356 ± 0.695），t＝4.662，P＝0.000 4］和［（2.729 ± 1.495）vs.（0.770 ± 0.265），t＝3.649，P＝0.002 6］。然而NTD 組的mRNA 含量與CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖3 各組血清TNF-α 和IL-1β 的含量（n=8）Fig.3 Serum TNF-α and IL-β levels（n=8）

2.5 Delta 阿片受體激活增加JAK2 和STAT3 蛋白磷酸化的表達(dá)與CON組相比，DALDE組磷酸化JAK2［（217.54±7.99）vs.100，t＝41.62，P＜0.000 1］和STAT3（Ser727 位點）［（192.54 ± 47.19）vs.100，t＝5.546，P＜0.000 1］蛋白含量明顯增高，而NTD組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

3 討論

肝臟IR 損傷是肝移植、肝腫瘤切除術(shù)以及肝臟外傷等手術(shù)中常見的并發(fā)癥，一直困擾著臨床醫(yī)生。然而其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前缺乏有效的治療手段。

缺血預(yù)處理（ischemia preconditioning，IPC）是之前被廣泛應(yīng)用的針對IR 損傷的臟器保護(hù)策略。1986年MURRY 等［9］首次在心臟IR 損傷上提出了“缺血預(yù)處理”的概念，即在長時間缺血前進(jìn)行數(shù)次短暫缺血、再灌注的循環(huán)可以減輕IR 損傷引起的損傷。1993年LLORIS 等［10］發(fā)現(xiàn)該預(yù)處理同樣對大鼠肝臟的IR 損傷也具有保護(hù)作用。盡管如此，IPC 的方案、保護(hù)時限和保護(hù)機(jī)制尚未完全闡明，并且因為倫理限制了其臨床運(yùn)用。近年來，用藥物尤其是麻醉藥物模擬IPC 以調(diào)動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制已成為肝臟麻醉領(lǐng)域的研究熱點。阿片受體激動劑是肝臟手術(shù)中常用的鎮(zhèn)痛藥，分為3個亞型。研究表明Delta 阿片受體激活其對心［11］、腦［12］和肝［13］IR 損傷具有保護(hù)作用。然而Delta 阿片受體的激活對硬化肝臟的作用如何，還未有研究。本研究結(jié)果首次顯示Delta 阿片受體激動劑DADLE 降低大鼠硬化肝臟血清ALT 和AST 水平。并且從H&E 染色可以看出，與CON 組相比，DADLE 組肝小葉相對完整，少量血液淤積和壞死面積。然而使用Delta 阿片受體拮抗劑的肝組織IR后，肝小葉破壞嚴(yán)重，肝索肝竇邊界不清，大量壞死面積。這些說明Delta 阿片受體激活可以減輕硬化大鼠肝臟IR 損傷，當(dāng)Delta 阿片受體被拮抗后，這種保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。這表明Delta 阿片受體對硬化肝臟IR 損傷的關(guān)鍵作用。

圖4 各組JAK2 和STAT3 mRNA 表達(dá)水平（n=8）Fig.4 The expression of JAK2 and STAT3 mRNA（n=8）

圖5 各組JAK2 和STAT3 蛋白表達(dá)（n=8）Fig.5 The expression of JAK2 and STAT3 protein（n=8）

肝臟IR 損傷的機(jī)制很復(fù)雜，目前有早發(fā)相和遲發(fā)相的假說。早發(fā)相與肝臟Kuppfer 細(xì)胞誘導(dǎo)的促前炎性因子如TNF-α 和IL-1 產(chǎn)生和釋放有關(guān)［14］。遲發(fā)相與中性粒細(xì)胞趨化有關(guān)［15］。由于再灌注6 h 是肝臟IR 早期損傷最嚴(yán)重的時候［16］，因此本研究選取再灌注6 h 的肝臟組織和血清進(jìn)行研究，并且主要研究肝臟IR 損傷早期相的相關(guān)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)DADLE 組大鼠血清TNF-α 和IL-1β 的含量比CON 組低，而NTD 組TNF-α 和IL-1β的含量與CON 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明Delta 阿片受體激活可以減輕前炎性因子TNF-α 和IL-1β 的釋放，從而達(dá)到抗炎的作用。

JAK2/STAT3 是生存活化因子增強(qiáng)（survivor activation factor enhancement，SAFE）的 關(guān) 鍵 通路［17］。STAT3 有兩個磷酸化的位點：絡(luò)氨酸（T705）和色氨酸（Ser727）位點。一旦STAT3 被JAK2 磷酸化，STAT3 蛋白即可通過其SH2 區(qū)形成二聚體而活化和隱藏T705 位點，隨后Ser727 位點磷酸化后的STAT3 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與靶基因的啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［18］。有研究［19］表明JAK2/STAT3 通路的激活可以減輕肝臟IR 損傷。STAT3 蛋白激活可以控制下游基因如BCL2 和BAX 轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而起到抗炎的作用［20］。還有研究［21］表明Delta 阿片受體可以激活JAK2/STAT3 通路來減輕心臟IR 損傷，而這種保護(hù)作用被STAT3 抑制劑AG490 所逆轉(zhuǎn)，JAK2/STAT3 通路是Delta 阿片受體介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵蛋白通路。本研究發(fā)現(xiàn)JAK2 和STAT3 的mRNA 表達(dá)以及磷酸化蛋白的含量在DADLE 組明顯增高。這表明Delta 阿片受體激活上調(diào)JAK2/STAT3 通路，進(jìn)而減少前炎性因子TNF-α 和IL-1β 的釋放達(dá)到抗炎的效果。這與上述文獻(xiàn)研究的結(jié)果相符合。然而JAK2/STAT3 通路是否是DADLE 肝臟保護(hù)的關(guān)鍵通路需要進(jìn)一步研究。

由于樣本量小，使得本研究具有局限性。并且確定JAK2/STAT3 的關(guān)鍵作用，還需要使用特異性的抑制劑或其他基因技術(shù)，這將在以后的基礎(chǔ)實驗中，進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究首次表明Delta 阿片受體激活能夠有效地減輕硬化肝臟IR 損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)JAK2/STAT3 通路進(jìn)而抑制的炎性介質(zhì)釋放有關(guān)。為臨床阿片受體的肝臟IR 損傷保護(hù)，提供基礎(chǔ)依據(jù)。