大熊貓?jiān)粗虏〈竽c桿菌CCHTP全基因組測(cè)序及耐藥和毒力基因分析

鄧雯文，李才武，趙思越，李仁貴，何永果，吳代福，楊盛智，黃炎，張和民，鄒立扣

大熊貓?jiān)粗虏〈竽c桿菌CCHTP全基因組測(cè)序及耐藥和毒力基因分析

鄧雯文1，李才武1，趙思越2，李仁貴1，何永果1，吳代福1，楊盛智2，黃炎1，張和民1，鄒立扣2

1. 中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，都江堰 611830 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 611130

致病性大腸桿菌是引起動(dòng)物泌尿系統(tǒng)感染的重要病原菌，本研究對(duì)泌尿生殖道感染出現(xiàn)潛血的大熊貓尿液中分離的一株致病性大腸桿菌(CCHTP)進(jìn)行全基因組測(cè)序，檢測(cè)其中耐藥基因和毒力因子的情況，同時(shí)對(duì)基因島上耐藥和毒力基因及其基因環(huán)境進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌CCHTP中存在多種類(lèi)型的耐藥基因，其中外排泵系統(tǒng)基因數(shù)量最多，包括A、E和N等介導(dǎo)多重耐藥外排泵的基因。此外，該菌還攜帶166種毒力因子及563個(gè)相關(guān)毒力基因，其中屬于黏附與侵襲類(lèi)的毒力因子及相關(guān)基因數(shù)量最多。對(duì)19個(gè)基因島分析發(fā)現(xiàn)，基因島GIs011和GIs017中各有一段包含耐藥和毒力基因的序列，兩側(cè)與可移動(dòng)遺傳元件(轉(zhuǎn)座酶和插入序列)相連，這些結(jié)構(gòu)可能介導(dǎo)耐藥及毒力基因水平轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)全基因組測(cè)序分析了大熊貓?jiān)粗虏⌒源竽c桿菌中存在的耐藥及毒力基因情況，對(duì)大熊貓相關(guān)疾病的科學(xué)治療、合理用藥有重要意義。

大熊貓；大腸桿菌；全基因組測(cè)序；耐藥基因；毒力因子

大腸桿菌()通常存在于人和動(dòng)物的胃腸道，屬于條件性致病菌，在宿主健康的情況下，可起到保護(hù)宿主、防止病原菌定植的作用，但在特定情況下會(huì)產(chǎn)生致病性[1]。此外，致病性大腸桿菌還可在胃腸道以外，如尿道、血液中生存并引起嚴(yán)重的疾病，它們具有廣泛的宿主譜，其防治仍是當(dāng)今世界性的難題，對(duì)大熊貓感染性疾病的發(fā)生有重要影響[2,3]。

目前，用于治療大熊貓細(xì)菌感染的藥物主要為抗生素，抗生素通過(guò)直接殺死或抑制病原菌的生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到治療效果，這種作用機(jī)理使細(xì)菌具有選擇壓力，并催生病原菌耐藥性的產(chǎn)生[4]。同時(shí)，由于耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移特性使耐藥性可在不同細(xì)菌種屬間進(jìn)行傳播，加速了耐藥水平的提高。研究表明大熊貓?jiān)创竽c桿菌已對(duì)不同大類(lèi)抗生素，如四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素呈現(xiàn)出不同程度耐藥[5]。此外，毒力因子是病原菌具有的能夠使其在宿主環(huán)境中定植、繁殖和致病的基因產(chǎn)物[6]。大腸桿菌的致病性是由多種毒力相關(guān)因子共同決定，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)，直接或間接參與與致病過(guò)程，進(jìn)而引發(fā)宿主有害炎癥反應(yīng)。近年來(lái)隨著基因組學(xué)的飛速發(fā)展，可從分子水平對(duì)毒力因子進(jìn)行研究，揭示病原菌致病機(jī)理[7]。

目前關(guān)于大熊貓?jiān)创竽c桿菌的研究主要集中在對(duì)大熊貓腸道內(nèi)大腸桿菌的分離鑒定、耐藥性檢測(cè)等[3,5,8]，但有關(guān)大熊貓腸外大腸桿菌相關(guān)的研究報(bào)道還較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)1株從泌尿生殖道感染出現(xiàn)潛血的大熊貓尿液中分離的大腸桿菌進(jìn)行全基因測(cè)序，研究耐藥及毒力因子情況，分析耐藥及毒力相關(guān)基因的環(huán)境，可對(duì)大腸桿菌致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)，為合理采用抗生素治療大熊貓大腸桿菌感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2017年5月從中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心一只泌尿生殖道感染出現(xiàn)潛血的大熊貓尿液中分離得到的大腸桿菌。

1.2 菌株純化鑒定

大腸桿菌使用EMB培養(yǎng)基和TSA劃線(xiàn)純化，將純化菌株腹腔注射小白鼠進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)[9]，確認(rèn)后按文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)和16S rDNA測(cè)序再次鑒定確認(rèn)，鑒定結(jié)果為大腸桿菌(CCHTP)。挑取單菌落，使用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)18~20 h，取1.8 mL過(guò)夜孵育的菌液到一個(gè)2 mL無(wú)菌離心管中，離心后吸掉上清培養(yǎng)基，獲取大腸桿菌沉淀用于后續(xù)DNA提取。

1.3 抗生素藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSL) 2019年發(fā)布的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[10]，采用K-B藥敏紙片法，選擇15種抗生素測(cè)定菌株的敏感性。利用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌落制備菌懸浮液至0.5麥?zhǔn)蠞舛?，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液涂布于MHA瓊脂平板上，鑷子滅菌后分別夾取藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，37℃恒溫培養(yǎng)16~18 h。按CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥性。選擇ATCC?25922,ATCC?35218作為質(zhì)控菌株。

1.4 DNA提取

根據(jù)UltraClean?Microbial DNA Isolation Kit試劑盒手冊(cè)，提取細(xì)菌DNA。取60 ng DNA樣品1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在80V電壓電泳30 min，檢測(cè)DNA濃度。

1.5 全基因組測(cè)序

將DNA送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司(Novogene)進(jìn)行3代Pacbio平臺(tái)測(cè)序。經(jīng)電泳檢測(cè)合格的DNA樣品用Covaris g-TUBE打斷成構(gòu)建文庫(kù)所需大小的目的片段，經(jīng)DNA損傷修復(fù)及末端修復(fù)后，使用DNA黏合酶將發(fā)卡型接頭連接在DNA片段兩端，使用AMpure PB磁珠對(duì)DNA片段進(jìn)行純化選擇，構(gòu)建SMRT Bell文庫(kù)。純化后的片段經(jīng)buffer回溶后，使用BluePipin片段篩選特定大小的片段，并使用AMpure PB磁珠對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit濃度定量，并利用Agilent 2100檢測(cè)插入片段大小，隨后用PacBio平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)。使用SMRT Link v5.0.1軟件對(duì)reads進(jìn)行組裝[11,12]，得到初步組裝結(jié)果，把reads比對(duì)到組裝序列上，統(tǒng)計(jì)測(cè)序深度的分布情況。將得到的初步組裝結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，并將染色體序列組裝成為一個(gè)環(huán)狀基因組，即最終的0 gap完成圖序列。使用GeneMarkS軟件(http://topaz.gatech.edu/)進(jìn)行細(xì)菌的編碼基因預(yù)測(cè)基因。注釋使用Blastn數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以及RAST[13]。采用毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Virulence Factors of Pathogenic Ba-cteria, VFDB)和抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(the Com-prehensive Antibiotic Research Database, CARD)[14]對(duì)菌株的基因組中所包含的毒力基因和耐藥基因進(jìn)行比對(duì)，使用IslandPath-DIOMB軟件預(yù)測(cè)基因島。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，獲得的大腸桿菌CCHTP對(duì)阿莫西林、氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、紅霉素、阿奇霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星和四環(huán)素耐藥，對(duì)氨曲南和卡那霉素敏感(附表1)。

2.2 大腸桿菌CCHTP全基因組測(cè)序結(jié)果

大腸桿菌CCHTP經(jīng)PacBio測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序后，通過(guò)對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行組裝，最終獲得1個(gè)contig，組裝的contigs總長(zhǎng)度為5120 663 bp，N50為5120 663 bp。通過(guò)組裝獲得一個(gè)長(zhǎng)度為5106 047 bp的環(huán)狀染色體序列(圖1)，鳥(niǎo)嘌呤–胞嘧啶(GC)含量為50.49%對(duì)基因組編碼基因預(yù)測(cè)，注釋得到的基因總數(shù)為4896，注釋得到的基因總長(zhǎng)度為4470 000 bp。對(duì)基因組非編碼RNA (ncRNA)預(yù)測(cè)，得到61個(gè)sRNA、22個(gè)rRNA (包括5S、16S、23S)和89個(gè)tRNA。

經(jīng)預(yù)測(cè)，共有4431個(gè)基因具有COG功能分類(lèi)，其中信息儲(chǔ)存和處理基因共745個(gè)，細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因共1194個(gè)，代謝類(lèi)基因共1945個(gè)，功能未知基因547個(gè)。菌株共有13 862個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)3大分支數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋到。共有43種功能注釋結(jié)果，其中細(xì)胞學(xué)組件類(lèi)有12個(gè)分支，共3360個(gè)注釋結(jié)果，生物學(xué)途徑類(lèi)有23個(gè)分支，共7432基因注釋結(jié)果，分子功能類(lèi)存在10個(gè)分支共4107個(gè)相關(guān)注釋結(jié)果。KEGG分析顯示，共1544 個(gè)基因富集在 192條代謝通路中，其中涉及基因最多的通路主要有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝通路(ko02010) (200個(gè)基因)、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)代謝通(ko02060) (142個(gè)基因)和嘌呤代謝通路(ko00230) (83個(gè)基因)。

圖1 大腸桿菌CCHTP基因組圖譜

從外圈至內(nèi)圈：1、2圈為編碼基因；3、4圈為eggNOG；4、5圈為KEGG；7、8圈為GO；9、10圈為ncRNA；11、12圈為基因組GC含量；13、14圈為基因組GC skew值分布。

2.3 大腸桿菌CCHTP中抗生素耐藥基因分析

通過(guò)對(duì)染色體基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌攜帶了多種類(lèi)型的抗生素耐藥基因，包括14大類(lèi)161個(gè)抗生素耐藥基因。從表1中可知，外排泵系統(tǒng)基因數(shù)量最多，主要包括B (13個(gè))、L (6個(gè))、A (6個(gè))、S (5個(gè))等115個(gè)耐藥基因。其次為介導(dǎo)糖肽類(lèi)抗生素(萬(wàn)古霉素)耐藥的TG/ TC/RI等10個(gè)耐藥基因、介導(dǎo)多肽類(lèi)抗生素(多粘菌素)耐藥的-3、F/E/C等9個(gè)耐藥基因和介導(dǎo)四環(huán)素類(lèi)抗生素(四環(huán)素)耐藥的tetT/B(60)/A(48)/ 34。此外，少量介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)等抗生素耐藥的基因也在基因組中識(shí)別到。

2.4 大腸桿菌CCHTP中毒力因子分析

經(jīng)VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌CCHTP共攜帶了166種毒力因子及563個(gè)相關(guān)毒力基因。按毒力因子大類(lèi)(黏附與侵襲、分泌系統(tǒng)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)菌毒素)來(lái)分析，發(fā)現(xiàn)屬于黏附與侵襲類(lèi)的毒力因子及相關(guān)基因數(shù)量最多，共有47種毒力因子及239個(gè)相關(guān)毒力基因，毒力基因數(shù)量前15的黏附與侵襲類(lèi)毒力因子如圖2所示，主要黏附因子包括5種菌毛類(lèi)：Type I fimbriae (Ⅰ型菌毛)、Type Ⅳ pili (Ⅳ型菌毛)、Pix pilus (Pix菌毛)、Pap pilus (盂腎炎相關(guān)菌毛/P菌毛)和common pilus (大腸桿菌共生菌毛)和3種鞭毛類(lèi)：Peritrichous flagella (周生鞭毛)、S fimbriae (S鞭毛)和P fimbriae (P鞭毛)。研究發(fā)現(xiàn)Peritrichous flagella相關(guān)毒力基因數(shù)量最多，包括Z/Y/T/S、A/B/C/D、N/M/L等51個(gè)毒力基因，其次為L(zhǎng)OS (脂寡糖)基因族中的F/E/D、K/H/ D/C等25個(gè)基因，Capsule (莢膜)基因族中的A、F、A等15個(gè)基因和TypeⅠ fimbriae基因族中的A/B/C等12個(gè)基因。

表1 大腸桿菌CCHTP中耐藥基因分析結(jié)果

分泌系統(tǒng)共發(fā)現(xiàn)16種毒力因子及76個(gè)相關(guān)毒力基因(圖3)。按照分泌系統(tǒng)類(lèi)型來(lái)看，共識(shí)別到5類(lèi)，屬于Ⅱ型分泌系統(tǒng)的毒力因子類(lèi)型最多，包括gspT2SSoutpulGspA和exe，其次為Ⅵ型分泌系統(tǒng)，包括ACE T6SSSCI-I T6SSCTS2和T6SS。其余3類(lèi)分泌系統(tǒng)各識(shí)別到兩種毒力因子，分別為T(mén)rehalose-recycling ABC transporter和ABC transporter (Ⅰ型分泌系統(tǒng))、T3SS和IcsP (SopA) (Ⅲ型分泌系統(tǒng))、CTS2和T6SS (Ⅵ型分泌系統(tǒng))。與ACE T6SS相關(guān)的毒力基因數(shù)量最多，主要為假定蛋白編碼基因17/18/22/23/26等19個(gè)基因，其次為SCI-I T6SS基因族中的3402、2814和82_ 443等17個(gè)基因。

圖2 黏附與侵襲類(lèi)主要毒力因子

圖3 分泌系統(tǒng)類(lèi)主要毒力因子

本研究共識(shí)別12種毒力因子及59個(gè)相關(guān)毒力基因?qū)儆阼F轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。如圖4所示，與毒力因子Enterobactin (腸細(xì)菌素)和血紅素合成(Heme biosyn-thesis)相關(guān)的基因數(shù)量最多。其次為Yersiniabactin siderophore (耶爾森菌素合成)、Yersiniabactin (耶爾森菌素)及Salmochelin (沙門(mén)菌素)。

如圖5，通過(guò)比對(duì)得到細(xì)菌毒素類(lèi)毒力因子11種，毒力基因36個(gè)。毒力因子主要包括5種溶血素：Alpha-hemolysin (α溶血素)、cytolysin A (溶血素A)、Hemolysin, HlyA (HlyA溶血素)、Hemolysin Ⅲ (Ⅲ型溶血素)和Beta-hemolysin (β溶血素)。研究發(fā)現(xiàn)Colibactin (聚酮肽基因毒素)相關(guān)毒力基因數(shù)量最多, 包括R/Q/P/O/N等19個(gè)基因。

2.5 大腸桿菌E. coli CCHTP中耐藥和毒力基因環(huán)境分析

在染色體序列共發(fā)現(xiàn)19個(gè)基因島，總長(zhǎng)在5187~74 031 bp之間，其中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因島GIs011和GIs017上各有一段含可移動(dòng)遺傳元件(插入序列)、毒力因子和耐藥基因的序列，基因環(huán)境繪圖如圖6所示，在基因島GIs011上發(fā)現(xiàn)一段序列包含外排泵基因調(diào)控因子(R)和四環(huán)素類(lèi)耐藥基因(A(60))，F(xiàn)1C菌毛(YH)和S菌毛(G/F/E/D/A/B/C) 相關(guān)基因，在這些基因兩側(cè)存在可移動(dòng)遺傳元件IS、轉(zhuǎn)座酶基因及IS。GIs017上也發(fā)現(xiàn)在一段包含外排泵基因、α-溶血素基因A/B/C/D及細(xì)菌毒素CNF-1，兩側(cè)分別與轉(zhuǎn)座酶基因、插入序列IS以及IS相連，大腸桿菌中的耐藥或毒力基因可由可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)傳播。

圖4 鐵轉(zhuǎn)運(yùn)主要毒力因子

圖5 細(xì)菌毒素主要毒力因子

圖6 抗生素耐藥基因和毒力基因環(huán)境

此外，對(duì)多肽類(lèi)耐藥基因-3及其側(cè)翼環(huán)境進(jìn)行分析(圖7)，發(fā)現(xiàn)基因-3一側(cè)與假定抗性蛋白(putative resistance protein, PRP)，并具有假定蛋白(hypothetical protein, HP)G。另一側(cè)與假定蛋白相連，并發(fā)現(xiàn)Capsule類(lèi)毒力基因F與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器和假定蛋白相連，另外在基因-3周?chē)蛄兄羞€發(fā)現(xiàn)chu類(lèi)毒力基因A和T以及外排泵基因L、X、W和E。

圖7 mcr-3基因環(huán)境

PRP: putative resistance protein，假定抗性蛋白；HP: hypothetical protein，假定蛋白。

3 討論

許多已知的病原菌都能引起尿路感染，如白色念珠菌()、肺炎克雷伯氏菌()、銅綠假單胞菌()、奇異變形桿菌()、金黃色葡萄球菌()和大腸桿菌等[15,16]。然而，目前對(duì)大熊貓泌尿生殖道感染的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌可引起大熊貓的泌尿生殖道血尿癥出現(xiàn)[17]。本研究從一只泌尿生殖道感染出現(xiàn)潛血的大熊貓尿液中分離出大腸桿菌CCHTP。通過(guò)全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌攜帶多種類(lèi)型的抗生素耐藥基因，并以外排泵基因?yàn)橹?，表明外排泵系統(tǒng)可能為大腸桿菌CCHTP產(chǎn)生耐藥性的主要因素。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)A、E、K和M等多重耐藥外排泵系統(tǒng)基因。目前已有大量研究表明多重耐藥外排泵能夠介導(dǎo)對(duì)抗生素、消毒劑、洗滌劑和染料等有毒化合物的內(nèi)在抗性[18]，阻止藥物在細(xì)菌體內(nèi)積聚，是細(xì)菌多重耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制之一[19]。其中，A外排泵能夠外排環(huán)丙沙星，卡那霉素、新霉素及季銨鹽類(lèi)消毒劑等[20,21]，K基因可表達(dá)細(xì)菌對(duì)諾氟沙星、阿霉素及吖啶黃的外排，E編碼的外排泵能外排四環(huán)素、紅霉素、結(jié)晶紫及染色劑溴化乙錠[22]。此外，研究檢測(cè)到四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，這與部分學(xué)者在大熊貓糞便源大腸桿菌檢測(cè)到耐藥基因結(jié)果相似[5,23]。四環(huán)素類(lèi)抗生素廣泛用于動(dòng)物疾病治療中，目前已發(fā)現(xiàn)40多種不同類(lèi)型的四環(huán)素耐藥基因，主要介導(dǎo)3種耐藥機(jī)制，分別為外排泵機(jī)制、核糖體保護(hù)機(jī)制和酶降解機(jī)制[24]，其中基因A和B可編碼主要易化子超家族(MFS)外排泵蛋白將四環(huán)素藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，四環(huán)耐藥基因T通過(guò)編碼核糖體保護(hù)機(jī)制，使耐藥細(xì)菌可以產(chǎn)生核糖體保護(hù)蛋白與核糖體結(jié)合引起構(gòu)型改變，從而弱化了對(duì)二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素的抑制作用，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[25]。研究還發(fā)現(xiàn)多粘菌素耐藥基因3，這種新型基因在2017年被Yin等[26]首次發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌的IncHI2質(zhì)粒中，其在大腸桿菌中的表達(dá)可有效阻止多粘菌素所引發(fā)的活性氧形成，并一定程度地對(duì)宿主細(xì)菌造成一定的代謝壓力。研究表明基因-3的氨基酸序列與前期發(fā)現(xiàn)的多粘菌素基因-1和2差異較大，僅有32.5%和31.7%的一致性[27]，具有多種亞型(如-3.3、-3.5和-3.7)，宿主范圍廣，主要發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌中[28]?；?3可由染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子等方式介導(dǎo)傳播[27,29]。Ling等[29]對(duì)氣單胞菌中有染色體介導(dǎo)的-3.3基因環(huán)境進(jìn)行分析，與本實(shí)驗(yàn)中-3基因環(huán)境對(duì)比發(fā)現(xiàn)具有部分相同的序列結(jié)構(gòu)，基因兩側(cè)均有假定蛋白，且其中一側(cè)與假定蛋白相連。但仍存在差異，表現(xiàn)為基因-3.3周?chē)蛄兄邪l(fā)現(xiàn)插入序列遺傳標(biāo)記IS。此外，-3基因可與其他耐藥基因共存[28,30,31]，Liu等[27]發(fā)現(xiàn)由-3位于IncP質(zhì)粒中的TnAs3轉(zhuǎn)座子上，并與IncHI2質(zhì)粒攜帶的基因-1和IncX3質(zhì)粒攜帶的基因NDM-5共存于一株大腸桿菌中，引起多重耐藥，進(jìn)一步增強(qiáng)宿主細(xì)菌的耐藥性。

近年來(lái)隨著人們對(duì)于各種毒力因子的逐步了解，一些毒力因子的致病機(jī)理也逐漸被揭示出來(lái)。通過(guò)與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌CCHTP攜帶了大量毒力因子及相關(guān)毒力基因。例如屬于黏附與侵襲類(lèi)毒力因子的Ⅰ型菌毛，其普遍存在于大腸桿菌中，主要在大腸桿菌致病的第一階段起作用[32,33]。Vizcarra等[33]研究顯示Ⅰ型菌毛還能產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素的抵抗能力，造成慢性感染發(fā)生，表明Ⅰ型菌毛對(duì)細(xì)菌抗生素耐藥性的產(chǎn)生有一定影響。研究檢測(cè)到了A/B/C/D/H等12個(gè)編碼Ⅰ型菌毛的基因，其中C和D主要在協(xié)調(diào)菌毛裝配及細(xì)菌致病過(guò)程中起作用，H介導(dǎo) 粘附作用[32]。此外，Ⅰ型菌毛和P菌毛都能介導(dǎo)大腸桿菌黏附于上尿道，也是尿道感染發(fā)生的重要因素[33,34]。此外，細(xì)菌毒素類(lèi)包含多種溶血素，其中α溶血素毒力基因A具有廣譜殺細(xì)胞作用，可作用于紅細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。Reijer等[36]研究表明溶血素在金黃色葡萄球菌生物膜形成等致病過(guò)程中也起著重要作用，增加了金葡菌的危害性。編碼毒素Colibactin相關(guān)毒力的基因數(shù)量最多，該毒素可導(dǎo)致慢性有絲分裂、染色體畸變和基因突變頻率增加，能夠引發(fā)腫瘤[37]。本研究通過(guò)對(duì)基因島分析發(fā)現(xiàn)，大量抗生素耐藥及毒力基因兩側(cè)存在插入序列。研究表明插入序列是染色體特殊組成部分，可攜帶耐藥基因轉(zhuǎn)移，同時(shí)插入序列可通過(guò)自身攜帶的轉(zhuǎn)座子提高耐藥基因表達(dá)量從而提高細(xì)菌耐藥程度[38,39]。因此，研究結(jié)果提示大腸桿菌中耐藥或毒力基因可能通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)傳播。

分泌系統(tǒng)和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)雖未直接涉及致病過(guò)程，但對(duì)細(xì)菌致病性的產(chǎn)生也至關(guān)重要。目前在革蘭氏陰性菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名9種不同類(lèi)型的分泌系統(tǒng)(Ⅰ~Ⅸ型)，致病菌借助分泌系統(tǒng)將特異蛋白直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)，可導(dǎo)致細(xì)菌的定殖和感染[40]。在本研究共識(shí)別到5類(lèi)(Ⅰ~Ⅳ型)，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性致病菌，如耶爾森氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、大腸桿菌、副溶血性弧菌等中[7,41]。沙門(mén)菌素和腸桿菌素是腸桿菌科病原菌中常見(jiàn)的鐵載體，其中腸桿菌素主要通過(guò)于血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵結(jié)合來(lái)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)而引起感染，與其他已知的鐵載體蛋白相比具有最高的鐵親和力[42]。

綜上所述，本研究通過(guò)全基因組測(cè)序技術(shù)首次對(duì)泌尿生殖道感染出現(xiàn)潛血的大熊貓尿液中分離的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，主要研究了其中毒力因子及耐藥基因情況，可較為全面地預(yù)測(cè)大腸桿菌中耐藥基因、耐藥譜、毒力因子及相關(guān)毒力基因等重要致病特性。研究結(jié)果可為圈養(yǎng)大熊貓臨床治療和合理用藥提供指導(dǎo)，為后續(xù)開(kāi)展圈養(yǎng)大熊貓?jiān)床≡卸玖σ蜃雍湍退幓蜓芯刻峁┮罁?jù)。

附錄：

附表1詳見(jiàn)文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 大腸桿菌CCHTP耐藥情況

Supplementary Table 1 Antibiotic resistance of E. coli CCHTP

[1] Li B, Li XL, Guo LJ, Long M, Guo F, He XM, Luo Y, Zou LK. Isolation and drug resistance analysis onin intestines from giant pandas., 2012, 25(3): 1109–1113.李蓓, 李旭林, 郭麗娟, 龍梅, 郭放, 何雪梅, 羅燕, 鄒立扣. 大熊貓腸道大腸桿菌的分離?鑒定及其耐藥性分析. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 25(3): 1109–1113.

[2] Johnson TJ, Wannemuehler Y, Kariyawasam S, Johnson JR, Logue CM, Nolan LK. Prevalence of avian-pathogenicstrain O1 genomic islands among extraintestinal and commensalisolates., 2012, 194(11): 2846–2853.

[3] Guo LJ, He XM, Deng WW, Wu GY, Long M, Li B, Zhang AY, Wang HN, Zou LK. Disinfectant resistance ofandisolated from giant panda., 2014, 33(6): 801–807.郭莉娟, 何雪梅, 鄧雯文, 吳國(guó)艷, 龍梅, 李蓓, 張安云, 王紅寧, 鄒立扣. 大熊貓?jiān)创竽c桿菌及肺炎克雷伯氏菌對(duì)消毒劑耐藥性研究. 四川動(dòng)物, 2014, 33(6): 801–807.

[4] Chen FF, Di HX, Lan LF. Small molecules targetingvirulence., 2013, 58(36): 3743–3572.陳菲菲, 狄紅霞, 藍(lán)樂(lè)夫. 金黃色葡萄球菌重要毒力因子的功能及其抑制劑研究進(jìn)展. 科學(xué)通報(bào), 2013, 58(36): 3743–3572.

[5] Guo LJ, Long M, Huang Y, Wu GY, Deng WW, Yang X, Li B, Meng Y, Cheng L, Fan LQ, Zhang HM, Zou LK. Antimicrobial and disinfectant resistance ofisolated from giant pandas., 2015, 119(1): 55–64.

[6] Webb SA, Kahler CM. Bench-to-bedside review: Bacterial virulence and subversion of host defences., 2008, 12(6): 234.

[7] Yin L, Qi KZ, Song XJ, Tu J. Type III secretion system 2 pathogenicity islands of., 2017, 44(12): 3031–3037.尹磊, 祁克宗, 宋祥軍, 涂健. 大腸桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)2毒力島研究進(jìn)展. 微生物學(xué)報(bào), 2017, 44(12): 3031–3037.

[8] Zou WC, Li CW, Yang X, Wang YX, Cheng GY, Zeng JX, Zhang XZ, Chen YP, Cai R, Huang QR, Feng L, Wang HN, Li DS, Zhang GQ, Chen YX, Zhang ZZ, Zhang HM. Frequency of antimicrobial resistance and integron gene cassettes inisolated from giant pandas () in China., 2018, 116: 173–179.

[9] Ma ZJ, Rui P, Lu CX, Yang CR, Liu XR, Wang QY, Liu YZ, Zhang JW. Isolation and identification of extraintestinal pathogenic, 2015, 31(2): 130–134.馬增軍, 芮萍, 逯春香, 楊彩然, 劉謝榮, 王秋悅, 劉曜綜, 張建文. 豬源腸外致病性大腸桿菌的分離與鑒定. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 130–134.

[10] CLSI. 2019. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 29th ed. CLSI supplement M100, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

[11] Li RQ, Zhu HM, Ruan J, Qian WB, Fang XD, Shi ZB, Li YR, Li ST, Shan G, Kristiansen K, Li SG, Yang HM, Wang J, Wang J. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing., 2010, 20(2): 265–272.

[12] Li RQ, Li YR, Kristiansen K, Wang J. SOAP: short oligonucleotide alignment program., 2008, 24(5): 713–714.

[13] Brettin T, Davis JJ, Disz T, Edwards RA, Gerdes S, Olsen GJ, Olson R, Overbeek R, Parrello B, Pusch GD, Shukla M, Thomason JA, Stevens R, Vonstein V, Wattam AR, Xia F. RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes., 2015, 5: 8365.

[14] Thomas M, Fenske GJ, Antony L, Ghimire S, Welsh R, Ramachandran A, Scaria J. Whole genome sequencing- based detection of antimicrobial resistance and virulence in non-typhoidalisolated from wildlife., 2017, 9: 66.

[15] Linhares I, Raposo T, Rodrigues A, Almeida A. Frequency and antimicrobial resistance patterns of bacteria implicatedin community urinary tract infections: a ten-year surveillance study (2000-2009),, 2013, 13: 19.

[16] Kulkarni R, Dhakal BK, Slechta ES, Kurtz Z, Mulvey MA, Thanassi DG. Roles of putative type II secretion and type IV pilus systems in the virulence of uropathogenic., 2009, 4(3): e4752.

[17] Wang CD, Lan JC, Luo L, Yang Z, Zhang ZR.-pathogen of urogenital hematuria of giant panda., 2006, 25(1): 83–85.王成東, 蘭景超, 羅娌, 楊智, 張?jiān)偃? 大熊貓感染性泌尿生殖道血尿癥病原一肺炎克雷伯氏桿菌, 四川動(dòng)物, 2006, 25(1): 83–85.

[18] Sulavik MC, Houseweart C, Cramer C, Jiwani N, Murgolo N, Greene J, DiDomenico B, Shaw KJ, Miller GH, Hare R, Shimer G. Antibiotic susceptibility profiles ofstrains lacking multidrug efflux pump genes., 2001, 45(4): 1126–1136.

[19] Xue Y, Zhang XY, Wang GX, Huan YP. Progress on active efflux system inconferring multidrug resistance., 2009, 31(6): 493–496.薛原, 張秀英, 王貴霞, 華育平. 大腸桿菌主動(dòng)外排系統(tǒng)的研究進(jìn)展. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(6): 493– 496.

[20] Zou LK, Meng JH, McDermott PF, Wang F, Yang QR, Cao GJ, Hoffmann M, Zhao SH, Presence of disinfectant resistance genes inisolated from retail meats in the USA., 2014, 69(10): 2644–2649

[21] Edgar R, Bibi E. MdfA, anmultidrug resistance protein with an extraordinarily broad spectrum of drug recognition., 1997, 179(7): 2274–2280.

[22] Ma C, Chang G. Structure of the multidrug resistance efflux transporterE from., 2004, 101(109): 2852–2857.

[23] Zou WC, Li CW, Yang X, Wang YX, Cheng GY, Zeng JX, Zhang XZ, Chen YP, Cai R, Huang QR, Feng L, Wang HN, Li DS, Zhang GQ, Chen YX, Zhang ZZ, Zhang HM. Frequency of antimicrobial resistance and integron gene cassettes inisolated from giant pandas () in China., 2018, 116: 173–179.

[24] Jurado-Rabadán S, de la Fuente R, Ruiz-Santa-Quiteria JA, Orden JA, de Vries LE, Agers? Y. Detection and linkage to mobile genetic elements of tetracycline resistance gene(M) inisolates from pigs., 2014, 10: 155–161.

[25] Nguyen F, Starosta AL, Arenz S, Sohmen D, D?nh?fer A, Wilson DN, Tetracycline antibiotics and resistance mechanisms., 2014, 395(5): 559–575.

[26] Yin WJ, Li H, Shen YB, Liu ZH, Wang SL, Shen ZQ, Zhang R, Walsh TR, Shen JZ, Wang Y. Novel plasmid- mediated colistin resistance gene-3 in, 2017, 8(3): e00543–17.

[27] Liu L, Feng Y, Zhang X, McNally A, Zong Z. New variant of mcr-3 in an extensively drug-resistantclinical isolate carrying-1 andNDM-5., 2017, 61(12): e01757–17.

[28] Xu YC, Zhong LL, Srinivas S, Sun J, Huang M, Paterson DL, Lei S, Lin JX, Li F, Tang ZC, Feng SY, Shen C, Tian GB, Feng YJ. Spread of-3 colistin resistance in China: An epidemiological, genomic and mechanistic study., 2018, 34: 139–157.

[29] Ling ZR, Yin WJ, Li H, Zhang QD, Wang XM, Wang Z, Ke YB, Wang Y, Shen JZ. Chromosome-mediated-3 variants infrom chicken meat., 2017, 61(11): e01272–17.

[30] Xiang R, Ye X, Tuo H, Zhang X, Zhang A, Lei C, Yang Y, Wang H, Co-occurrence of-3 andNDM-5 genes in multidrug-resistantST709 from a commercial chicken farm in China., 2018, 52(4): 519–520.

[31] Hernández M, Iglesias MR, Rodríguez-Lázaro D, Gallardo A, Quijada NM, Miguela-Villoldo P, Campos MJ, Píriz S, López-Orozco G, de Frutos C, Sáez JL, Ugarte-Ruiz M, Domínguez L, Quesada A. Co-occurrence of colistin- resistance genes-1 and-3 among multidrug- resistantisolated from cattle, Spain, September 2015., 2017, 22(31): 1–5.

[32] Liu HY, Wang JW, Wang J, Li YQ, Huang XM, Qu ZN. Research progress of avianvirulence factors., 2013, 30(10): 25–28, 29.劉紅玉, 王君瑋, 王娟, 李玉清, 黃秀梅, 曲志娜. 禽大腸桿菌毒力因子的研究進(jìn)展. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2013, 30(10): 25–28, 29.

[33] Vizcarra IA, Hosseini V, Kollmannsberger P, Meier S, Weber SS, Arnoldini M, Ackermann M, Vogel V. How type 1 fimbriae helpto evade extracellular antibiotics., 2016, 6: 18109.

[34] Guo X, Kong LC, Liu SM, Ma HX. Progress on virulence factors in extraintestinal pathogenic.,2015, 37(5): 405–408.郭霞, 孔令聰, 劉樹(shù)明, 馬紅霞. 動(dòng)物源腸外致病性大腸桿菌毒力因子研究進(jìn)展. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 37(5): 405–408.

[35] Landraud L, Gibert M, Popoff M, Boquet P, Gauthier M. Expression ofbyJ96 involves a large upstream DNA region including theCABD operon, and is regulated by the RfaH protein., 2003, 47(6): 1653–1667.

[36] den Reijer PM, Haisma EM, Lemmens-den Toom NA, Willemse J, Koning RI, Demmers JAA, Dekkers DHW, Rijkers E, Ghalbzouri AE, Nibbering PH, van Wamel W. Detection of alpha-toxin and other virulence factors in biofilms ofon polystyrene and a human epidermal model., 2016, 11(1): e0145722.

[37] Yang YT, Qu CM, Li LY. Effect and mechanism of intestinal bacteria flora on colorectal cancer., 2016, 21(5): 315–318.楊永濤, 屈昌民, 李連勇. 腸道菌群在結(jié)直腸癌中的作用及其機(jī)制. 胃腸病學(xué), 2016, 21(5): 315–318.

[38] Mojica FJM, Díez-Villase?or C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements., 2005, 60(2): 174–182.

[39] Wang HT, Liu NN, Ling BD. The effect of the insert sequenceon the expression of carbapenemase gene in multidrug-resistant, 2014, 39(3): 229–233.王同慧, 劉男男, 凌保東. 插入序列對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因表達(dá)的影響. 中國(guó)抗生素雜志, 2014, 39(3): 229–233.

[40] Mu LL, Niu B, Zhao Y. Role ofsecretion system in pathogenicity., 2019, 59(4): 621–631.穆麗麗, 牛犇, 趙勇. 副溶血性弧菌分泌系統(tǒng)在致病力中作用的研究進(jìn)展. 微生物學(xué)報(bào), 2019, 59(4): 621–631.

[41] Wang L, Wang YM, Yue JJ, Liang L, Huang PT. Progress in type III secretion system., 2004, 44(6): 840–844.汪莉, 王玉民, 岳俊杰, 梁龍, 黃培堂. Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶研究進(jìn)展. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(6): 840–844.

[42] Chen Y, Liu JL, Qu HP. Mechanistic research on the role of siderophores in enhancing the virulence of, 2016, 16(6): 804–807.陳楊, 劉嘉林, 瞿洪平. 鐵載體對(duì)肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)的機(jī)制研究. 中國(guó)感染與化療雜志, 2016, 16(6): 804– 807.

Whole genome sequencing reveals the distribution of resistance and virulence genes of pathogenicCCHTP from giant panda

Wenwen Deng1, Caiwu Li1, Siyue Zhao2, Rengui Li1, Yongguo He1, Daifu Wu1, Shengzhi Yang2, Yan Huang1, Hemin Zhang1, Likou Zou2

Pathogenicis the most common pathogen causing urinary tract infection in animals. We investigated the antibiotic resistance and virulence genes of pathogenicCCHTP derived from urine with occult blood of the giant panda by whole genome sequencing. The flanking sequencing of resistance and virulence genes in genomic islands were also analyzed. Our results demonstrate thatCCHTP contains different families of antibiotic resistance genes, most of which are efflux pump relatedgenes, including multiple drug resistance efflux pump genesA,E, andN. A total of 166 virulence factors and 563 virulence genes were identified, and the most virulence factors and related genes are involved in host cell attachment and invasion processes. Furthermore, sequence analysis of 19 genomic islands revealed that antibiotic and virulence genes are associated with mobile genetic elements (transposon and insertion sequence) in GIs011 and GIs017. These structures can mediate horizontal transfer of antibiotic and virulence genes. Our work described the distribution of antibiotic resistance genes and virulence genes inCCHTP, which may provide an important guidance for treatment and rational drug use ofCCHTP infection in the giant panda.

giant panda;; whole genome sequencing; resistance gene; virulence gene

2019-09-17;

2019-11-25

中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心項(xiàng)目(編號(hào)：CCRCGP181918)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31400066)資助[Supported by the Project of China Conservation and Research Center for the Giant Panda (No. CCRCGP181918) and the National Natural Science Foundation of China (No. 31400066)]

鄧雯文，碩士研究生，研究方向：大熊貓分子遺傳學(xué)。E-mail: dwenwen130@163.com李才武，碩士研究生，高級(jí)工程師，研究方向：大熊貓臨床獸醫(yī)。E-mail: 83330019@qq.com鄧雯文和李才武并列第一作者。

鄒立扣，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物資源利用、細(xì)菌耐藥性。E-mail: zoulikou@sicau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-243

2019/11/28 11:20:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191127.1143.004.html

(責(zé)任編委: 謝建平)