雞胰島素降解酶基因環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本克隆及其表達(dá)規(guī)律

冷奇穎，鄭嘉輝，徐海冬，Patricia Adu-Asiamah，張穎，杜炳旺，張麗

雞胰島素降解酶基因環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本克隆及其表達(dá)規(guī)律

冷奇穎，鄭嘉輝，徐海冬，Patricia Adu-Asiamah，張穎，杜炳旺，張麗

廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088

本課題組前期通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，雞胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)基因可能存在一個(gè)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。為確定基因環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本()的真實(shí)存在，探究其表達(dá)規(guī)律，本研究以吉林蘆花雞為研究對(duì)象，通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證了的真實(shí)存在，通過RNase R處理和反轉(zhuǎn)錄證實(shí)了的環(huán)形結(jié)構(gòu)，通過qRT-PCR分析和mRNA的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，并對(duì)比分析了和線性mRNA在正常體型蘆花雞和突變的矮小體型蘆花雞中的表達(dá)差異。結(jié)果表明：雞全長為1332 nt，由基因外顯子2~11環(huán)化形成。RNase R耐受性分析表明，雞具備環(huán)形分子的一般特征，不易被RNase R降解。與oligo-d(T)18引物相比，隨機(jī)引物對(duì)具有較高的反轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)一步說明是一個(gè)不含poly(A)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)分子。組織表達(dá)譜結(jié)果表明，在1周齡和12周齡正常體型蘆花雞肝臟和心臟高表達(dá)，在胸肌和腿肌中低表達(dá)；在肝臟組織的時(shí)序表達(dá)譜結(jié)果表明，在雞6周齡之前為低表達(dá)，在8周齡以后表現(xiàn)為高表達(dá)；正常與矮小體型蘆花雞品系間表達(dá)量對(duì)比分析表明，正常體型蘆花雞表達(dá)水平高于矮小體型蘆花雞，其中在肝臟組織中差異顯著(<0.05)。本研究證實(shí)了雞基因存在一個(gè)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，并初步揭示了的表達(dá)規(guī)律，在正常體型和矮小體型蘆花雞肝臟組織中表達(dá)量存在差異，本研究結(jié)果為深入開展雞的生物學(xué)功能及其在雞生長發(fā)育過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

雞；胰島素降解酶；環(huán)狀RNA；可變剪接

胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)是一種在進(jìn)化上保守的中性巰基金屬內(nèi)肽酶，在多種細(xì)胞內(nèi)的胰島素降解過程中發(fā)揮重要作用[1~3]。IDE對(duì)胰島素的分解作用是胰島素在體內(nèi)分解代謝的主要途徑[4~6]。此外，研究顯示IDE還具有降解β-淀粉樣蛋白、胰島淀粉樣多肽和胰高血糖素等多肽的能力[7]。IDE通過對(duì)多肽的降解作用來維持血糖平衡。由于IDE具有降解β-淀粉樣蛋白的作用，因此也被認(rèn)為是一種對(duì)抗阿茲海默病的新分子[8,9]。

基因轉(zhuǎn)錄的前體mRNA(pre-mRNA)既可以通過剪接作用形成線性mRNA，也可以通過反向剪接作用引起pre-mRNA的3′端和5′端發(fā)生共價(jià)連接從而形成環(huán)狀RNA (circular RNA, circRNA)[10,11]。因此，circRNA與線性RNA相比，circRNA具有不含5′帽子及3′尾巴結(jié)構(gòu)特征[12]，這一特征使circRNA具有較高的穩(wěn)定性[13]。此外，circRNA還具有時(shí)空表達(dá)特異性[14]、序列保守性[15]、序列來源多為外顯子[16]等特點(diǎn)。circRNA的生成受多種因素調(diào)控，最新研究已經(jīng)證實(shí)，內(nèi)含子反向互補(bǔ)序列、RNA結(jié)合蛋白、先天性免疫、細(xì)胞的全能性等一系列因素可以調(diào)控circRNA的生成[17]。同時(shí)，circRNA以多種方式調(diào)控機(jī)體的生理活動(dòng)[18~21]，其中對(duì)母源基因的調(diào)控作用是circRNA發(fā)揮作用的重要方式[17]。由于基因的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本和線性轉(zhuǎn)錄本均來源于同一個(gè)母源基因，circRNA和mRNA可能存在競爭調(diào)控關(guān)系[20]。已有證據(jù)表明，circRNA也參與胰島素代謝調(diào)控[22]。

雞基因定位于6號(hào)染色體，全長55 kb，包含25個(gè)外顯子。本課題組前期對(duì)雞肝臟細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序(GenBank登錄號(hào)：PRJNA554754)，發(fā)現(xiàn)基因可能存在環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本()。因此，本研究通過基因克隆技術(shù)驗(yàn)證了的真實(shí)存在，分析了其環(huán)形結(jié)構(gòu)特征及組織和時(shí)序表達(dá)規(guī)律，并對(duì)比分析了其在正常體型蘆花雞和突變的矮小體型蘆花雞中的表達(dá)差異。本研究結(jié)果為今后深入分析在胰島素代謝和動(dòng)物機(jī)體發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1日齡正常體型蘆花雞和基因突變而矮化的矮小體型吉林蘆花雞均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。HiPure Universal RNA Mini Kit(R4130)和DNase On Column Kit(R4911)購自廣州美基生物科技有限公司；RNase R(R0301)購自廣州吉賽生物股份有限公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A, TaKaRa)和pMD18-T載體(6011)購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；Trans-Start Top Green qRT-PCR SuperMix試劑盒(AQ101- 03)、TransStart KD Plus DNA Polymerase(AP301-02)和DH5α感受態(tài)大腸桿菌(CD201-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)及組織采集

1日齡正常體型蘆花雞和矮小體型蘆花雞佩戴翅號(hào)后，混籠飼養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，采用自由采食和飲水的方式進(jìn)行飼養(yǎng)(日糧標(biāo)準(zhǔn)見表1)，并進(jìn)行常規(guī)免疫。在1、2、3、4、5、6、8和12周齡的最后1 d隨機(jī)抽取6只蘆花雞母雞(正常/矮小雞各3只)進(jìn)行樣品采集，分別采集胸肌、腿肌、肝臟、十二指腸和心臟等組織，液氮速凍后置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雞IDE基因環(huán)形和線性轉(zhuǎn)錄本引物設(shè)計(jì)

針對(duì)的環(huán)形接頭位置，在接頭位置兩端設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別為(1)分散引物circiDE-D，用于環(huán)狀分子的驗(yàn)證；(2)全長擴(kuò)增引物circIDE- full，用于克隆分子全長序列；(3)定量引物circIDE-DL用于該分子的定量分析。此外，在基因非序列來源處設(shè)計(jì)線性mRNA (參考序列：XM_004942157.3)的定量引物(IDE-DL)。

內(nèi)參基因?yàn)椤Ｒ锞ㄟ^primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)，引物信息見表2，引物在基因上的位置及擴(kuò)增示意圖見圖1。

1.4 蘆花雞肝臟等組織總RNA提取及環(huán)狀性質(zhì)分析

按照HiPure Universal RNA Mini Kit試劑盒說明書分別提取1、2、3、4、5、6、8、10和12周齡正常體型蘆花雞肝臟、胸肌、腿肌、心臟和十二指腸等組織總RNA，并使用1%的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，使用BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度和純度，依據(jù)PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書，使用隨機(jī)引物(N9)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

表1 試驗(yàn)雞只日糧營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)

表2 引物序列信息

圖1 雞circIDE來源及引物位置示意圖

將提取的1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織總RNA分裝為兩份(每份5 ng)，一份使用超純水稀釋至20 μL保存?zhèn)溆?；另一份進(jìn)行RNase R處理，反應(yīng)體系包括RNA 5 ng、10× Reaction Buffer 2 μL、RNase R 20 U，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃孵育30 min后85℃滅活RNase R 5 s，經(jīng)RNase R處理后的RNA用于環(huán)狀性質(zhì)特征驗(yàn)證。依據(jù)PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書，分別使用隨機(jī)引物(N9)和oligo-d(T)18將未經(jīng)RNase R處理的1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA用于qRT-PCR定量分析的表達(dá)水平；隨機(jī)引物和oligo-d(T)18引物反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于qRT-PCR 進(jìn)行不同反轉(zhuǎn)錄引物的效率分析，進(jìn)一步分析的環(huán)狀結(jié)構(gòu)特征。

1.5 蘆花雞circIDE環(huán)狀特征驗(yàn)證及其克隆

經(jīng)RNase R處理的1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織RNA，通過隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別使用環(huán)狀驗(yàn)證引物(circIDE-D)和全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后將獲得的目標(biāo)產(chǎn)物連接載體pMD18-T后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，對(duì)菌株進(jìn)行陽性鑒定后由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，分析的序列信息和成環(huán)特征。

1.6 蘆花雞circIDE的表達(dá)特征分析

以1.4中獲得的cDNA為模板，采用qRT-PCR分析的時(shí)空表達(dá)規(guī)律及環(huán)狀特征。反應(yīng)體系為20 μL：2×TransStart?Top Green qPCR supermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，去離子水 8 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，59℃退火和延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用2–ΔΔCT方法計(jì)算qRT-PCR結(jié)果，用IBM SPSS 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件19進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均數(shù)(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞circIDE連接成環(huán)驗(yàn)證及其全長序列分析

依據(jù)本課題組前期高通量測(cè)序結(jié)果，本研究針對(duì)連接成環(huán)的接頭位置設(shè)計(jì)特異性分散引物，以經(jīng)過RNase R處理后的1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在265 bp位置生產(chǎn)了符合接頭位置片段長度的預(yù)期目標(biāo)的片段(圖2A)，初步表明基因存在反向剪接產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果顯示，連接成環(huán)的接頭片段序列來源于基因的外顯子2和11 (圖2B)，說明的接頭位置由外顯子2和外顯子11共價(jià)連接形成。進(jìn)一步使用全長擴(kuò)增引物經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，正常蘆花雞序列包含基因外顯子2~11 (圖2C)，全長為1332 nt，由基因外顯子2的5￠端和外顯子11的3′端反向剪接成環(huán)(GenBank登錄號(hào)：MN183275)。

圖2 雞circIDE全長克隆及結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

A：接頭位置擴(kuò)增結(jié)果。M：DL2000 maker；泳道1~4：以1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織cDNA為模板，circIDE-D引物擴(kuò)增結(jié)果。B：circIDE-D引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。C：全長擴(kuò)增結(jié)果。M：DL2000 maker；泳道1：以1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織cDNA為模板，circIDE-full引物擴(kuò)增產(chǎn)物。D：雞結(jié)構(gòu)示意圖。

2.2 雞circIDE分子RNase R耐受性及不同反轉(zhuǎn)錄引物的反轉(zhuǎn)錄效率分析

環(huán)形RNA分子具有RNase R耐受性，不易被RNase R降解；而線性RNA分子不具備RNase R耐受性。為了確認(rèn)雞具備環(huán)形分子的一般特征，本研究分析了雞的RNase R耐受性。以1周齡正常體型蘆花雞組織總RNA為材料，經(jīng)RNase R處理后，使用隨機(jī)引物(N9)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR結(jié)果顯示，使用RNase R處理后，的表達(dá)豐度無明顯下降(>0.05)，反而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但是線性分子mRNA 經(jīng)RNase R處理后下降極顯著(<0.01) (圖3A)，說明具有較強(qiáng)的RNase R耐受性。此外，以1周齡正常體型蘆花雞肝臟組織總RNA為模板，分別使用oligo-d(T)18和隨機(jī)引物(N9)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR比較的反轉(zhuǎn)錄效率。結(jié)果表明，用oligo-d (T)18引物反轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)豐度僅為隨機(jī)引物的2%，差異極顯著(<0.01)。而線性mRNA的表達(dá)豐度不受反轉(zhuǎn)錄引物的影響(圖3B，>0.05)。因此，與oligo-d (T)18引物的反轉(zhuǎn)錄效果相比，隨機(jī)引物對(duì)具有較好的反轉(zhuǎn)錄效果，同時(shí)也說明是一個(gè)不含poly(A)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀分子。

圖3 雞circIDE和IDE mRNA對(duì)RNase R耐受性及反轉(zhuǎn)錄特征分析

A：RNase R對(duì)和mRNA表達(dá)豐度的影響；B：不同反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)和mRNA 表達(dá)豐度的影響。RNase R(–)：未經(jīng)RNase R處理的總RNA；RNase R(+)：經(jīng)RNase R處理后的總RNA；**表示<0.01，差異極顯著。

2.3 雞circIDE和線性IDE mRNA的時(shí)空表達(dá)規(guī)律

分別提取1~12周齡正常體型蘆花雞肝臟、胸肌、腿肌、心臟和十二指腸等組織的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR對(duì)和mRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在1周齡正常體型蘆花雞的肝臟和心臟組織中高表達(dá)而在腿肌和胸肌組織中低表達(dá)(圖4A)，在12周齡正常體型蘆花雞的十二指腸、心臟和肝臟中高表達(dá)，而在胸肌和腿肌中低表達(dá)(圖4B)。通過分析1~12周齡正常體型蘆花雞肝臟中的時(shí)序表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在雞6周齡之前為低表達(dá)，在8周齡以后表現(xiàn)為高表達(dá)(圖4C)。而雞線性mRNA 在1~12周齡期間隨雞的生長發(fā)育表達(dá)量呈逐步上升趨勢(shì)(圖4D)。

圖4 雞circIDE和IDE mRNA的時(shí)空表達(dá)規(guī)律

A：1周齡正常體型蘆花雞不同組織中的表達(dá)規(guī)律；B：12周齡正常體型蘆花雞不同組織中的表達(dá)規(guī)律；C：1~12周齡正常體型蘆花雞肝臟組織中的表達(dá)規(guī)律；D：1~12周齡正常體型蘆花雞肝臟中mRNA的表達(dá)規(guī)律。*表示<0.05，差異顯著；**表示<0.01，差異極顯著。

2.4 circIDE和線性IDE mRNA在正常體型和矮小體型蘆花雞中的表達(dá)分析

以1周齡正常體型蘆花雞中高表達(dá)的肝臟和十二指腸組織的cDNA為模板，qRT-qPCR對(duì)比分析1周齡正常體型蘆花雞和1周齡矮小體型蘆花雞和線性mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，和線性mRNA在正常和矮小體型蘆花雞品系間存在表達(dá)差異。和線性mRNA在正常體型蘆花雞中的表達(dá)水平均高于矮小體型蘆花雞，其中在正常體型蘆花雞肝臟組織中表達(dá)量顯著高于矮小體型蘆花雞(<0.05) (圖5A)，而線性mRNA在正常體型蘆花雞十二指腸組織中的表達(dá)量顯著高于矮小體型蘆花雞(<0.05) (圖5B)。

3 討論

本研究克隆了雞基因的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)由該基因外顯子2和外顯子11反向剪接形成。查閱cirBase數(shù)據(jù)庫(http://circrna.org/)發(fā)現(xiàn)人和小鼠的基因也存在環(huán)狀RNA[23,24]。人基因產(chǎn)生的28個(gè)環(huán)狀RNA中，有11個(gè)環(huán)狀RNA是由外顯子2與其他外顯子反向剪接形成，其中hsa_circ_0094470與雞一樣，也是由外顯子2和11環(huán)化形成。與人和雞基因序列相比，小鼠基因缺少一個(gè)外顯子。在cirBase數(shù)據(jù)庫中注釋的小鼠基因有6個(gè)環(huán)狀RNA，其中4個(gè)環(huán)狀RNA是由外顯子1與其他外顯子反向剪接形成。因此，基因成環(huán)的特征在雞、人和小鼠之間具有物種保守性，外顯子2可能是一個(gè)保守性的反向剪接位點(diǎn)，表明可能在人和動(dòng)物發(fā)育過程中具有重要作用。

環(huán)狀RNA具有不含poly(A)序列的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，因此oligo-d(T)18引物反轉(zhuǎn)錄獲得的豐度低于隨機(jī)引物，提示在環(huán)形RNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)宜選用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，同時(shí)該結(jié)果也間接表明是一個(gè)頭尾相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNase R是一種靶向線性RNA分子并對(duì)其具有切割作用的核酸酶，其對(duì)環(huán)形分子不敏感[25]。本研究表明，雞對(duì)RNase R表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，經(jīng)RNase R處理后總RNA，表達(dá)量變化不顯著，進(jìn)一步說明雞具備環(huán)形分子的一般特征。

研究表明，基因的環(huán)形和線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)存在相關(guān)性[24]，本研究通過qRT-PCR分析表明，雞的時(shí)序表達(dá)規(guī)律與其線性mRNA相似。此外，雞的表達(dá)具有時(shí)序規(guī)律性，在1周齡正常蘆花雞中的肝臟組織表現(xiàn)高表達(dá)，而在12周齡正常體型蘆花雞中的十二指腸組織中表現(xiàn)為高表達(dá)。具有分解胰島素樣生長因子的作用[2]，這可能與雞消化系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)。雞在多種組織均有表達(dá)，但存在組織差異性。在肝臟組織中高表達(dá)而在肌肉組織中低表達(dá)。

環(huán)狀RNA可以通過多種模式對(duì)其母源基因或其靶基因發(fā)揮調(diào)控作用：(1)通過與U1 snRNP結(jié)合，正向調(diào)控母源的轉(zhuǎn)錄[26]；(2)直接與線性mRNA競爭pre-mRNA，調(diào)控線性mRNA的表達(dá)[17]；(3)與母源基因結(jié)合，形成DNA-RNA結(jié)合，抑制母源基因的轉(zhuǎn)錄[19]；(4)環(huán)狀RNA可以吸附miRNA，發(fā)揮分子海綿功能，參與基因調(diào)控[11]。來源于基因的外顯子2~11，屬于外顯子來源的環(huán)狀RNA，由于屬于EciRNA環(huán)狀RNA，其序列來源不含有內(nèi)含子序列，因此，無法與U1 snRNP結(jié)合促進(jìn)母源基因表達(dá)的功能[26]?；蛐蛄邪嘶虻?0個(gè)外顯子，含有大量的基因結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)可能通過與基因結(jié)合形成DNA-RNA復(fù)合物，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)功能。此外，已有兩個(gè)circRNA分子被證實(shí)可以通過發(fā)揮海綿機(jī)制調(diào)控胰島素分泌，可以發(fā)揮miR-7的分子海綿，調(diào)節(jié)胰島素的代謝[22,27,28]，也可以通過海綿機(jī)制吸附miR-124-3p和miR-338-3p調(diào)控胰島素的代謝[29]。在TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org)對(duì)雞進(jìn)行miRNA靶向預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在小分子miRNA Let-7b的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)有可能充當(dāng)Let-7b的分子海綿參與靶基因的調(diào)控。關(guān)于雞的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，以期為將來挖掘雞分子育種新靶點(diǎn)，精確調(diào)控雞生長發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

圖5 circIDE、IDE mRNA在正常和矮小體型蘆花雞中的表達(dá)對(duì)比

A：1周齡正常體型和矮小體型蘆花雞的表達(dá)差異；B：1周齡正常體型和矮小體型蘆花雞mRNA的表達(dá)差異。*表示<0.05，差異顯著。

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Cloning and expression analysis of chicken circular transcript of insulin degrading enzyme gene

Qiying Leng, Jiahui Zheng, Haidong Xu, Patricia Adu-Asiamah, Ying Zhang, Bingwang Du, Li Zhang

Insulin-degrading enzyme (IDE) is a highly conserved metallopeptidase that functions in the catabolism of bioactive peptides. In our previous study, we identified a putative circular transcript in that chicken insulin-degrading enzyme () gene through analyzing a high throughput sequencing result. Here we set to confirm the circular transcript of() and explore its expression regularity in normal barred Plymouth chicken. Thewas confirmed by PCR amplification and sequencing. The circular structure ofwas determined by RNase R processing and reverse transcription experiments. Then we analyzed the spatiotemporal expression pattern ofandmRNA and compared the differential expression ofandmRNA in the normal barred Plymouth chicken and the dwarf ones. The results showed that the full length of chickenwas 1332 nt, divided form exon 2-11 of thegene. RNase R tolerance analysis showed that chickenhad the general characteristics of circular molecule, and was highly resistant to RNase R. The random primers had higher transcription efficiency than the oligo-d(T)18primers, confirming thatis a circular structured molecule without poly(A).was highly expressed in the liver and heart tissues but less in the muscle tissues of leg and breast in normal chickens at the age of 1 and 12 weeks. Theexpression profile ofin liver tissue showed thatlevel was lower in1 to 6 weeks and then became higher after 8 weeks of age. The expression ofin liver tissue was significantly higher in normal chicken than that in dwarf barred Plymouth chicken (<0.05). This study confirmed astrucutre in chickengene and uncovered its expression regularity. We demonstrated that the expression level ofin the liver tissue was higher in normal barred Plymouth chicken compared to dwarf species. This study paves the way for further understanding the biological function of chickenincluding its roles in regulating chicken growth and development.

chicken; insulin degrading enzyme; circRNA; alternative splicing

2019-05-30;

2019-11-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31672412，31972550)，廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2017A030307002)和農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(編號(hào)：201501)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31672412, 31972550), the Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2017A030307002) and the Opening Project of Key Laboratory of Chicken Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Agriculture of China (No. 201501)]

冷奇穎，碩士研究生，專業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail: lengqiying1995@163.com

張麗，博士，教授，研究方向：家禽遺傳育種與繁殖。E-mail: zhangli761101@163.com

10.16288/j.yczz.19-157

2019/12/7 17:08:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191206.0936.004.html

(責(zé)任編委: 李輝)