Myomaker和Myomerger調(diào)控成肌細胞融合的分子機制

朱艷，張進威，齊婧，李學偉，陳磊，李明洲，馬繼登

Myomaker和Myomerger調(diào)控成肌細胞融合的分子機制

朱艷1，張進威1，齊婧1，李學偉1，陳磊2，李明洲1，馬繼登1

1. 四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130 2. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460

骨骼肌形成是一個復雜的生理過程，主要涉及肌源性干細胞增殖形成成肌細胞，進而分化、融合形成多核肌管。研究發(fā)現(xiàn)，有多種蛋白參與成肌細胞融合過程，但它們均不具有肌肉特異性。近年來，兩種肌肉特異性膜蛋白Myomaker和Myomerger先后被發(fā)現(xiàn)和鑒定，它們能協(xié)調(diào)促進成肌細胞融合，從而參與骨骼肌形成過程。本文對成肌過程中和的表達模式、功能域等研究現(xiàn)狀及其參與成肌細胞的融合機制進行了綜述，旨在為深入研究骨骼肌形成過程及治療肌細胞融合相關(guān)疾病提供參考信息。

骨骼肌形成；；；細胞融合

骨骼肌形成(myogenesis)是一個復雜的生理過程，包括胚胎和幼年的肌肉發(fā)育以及成年肌肉損傷后再生過程[1]。成肌調(diào)控因子(myogenic regulatory factors, MRFs)的時序性表達促進了肌肉結(jié)構(gòu)和功能的完善，對成肌命運決定和肌管分化至關(guān)重要[2]。單核成肌細胞或肌原性祖細胞被激活進而融合形成多核肌管是成肌的關(guān)鍵步驟[3,4]，研究表明這一過程受多種蛋白的協(xié)作調(diào)控，但很少涉及肌肉特異性的調(diào)控蛋白。直到2013年，美國德克薩斯大學達拉斯西南醫(yī)學中心的Millay團隊[5]發(fā)現(xiàn)TMEM8c(并命名為Myomaker)是一種能直接調(diào)控成肌細胞融合的肌肉特異性膜蛋白。Myomaker含有7個跨膜域[6]且在骨骼肌生成和損傷修復過程中瞬時高豐度表達，能有效促進成肌細胞融合[5,7]。2017年，另一種肌肉特異性融合蛋白GM7325被發(fā)現(xiàn)和鑒定，并命名為Myomerger (也稱Minion或Myomixer)。能促進融合性細胞 (如成肌細胞) 間發(fā)生融合，當與共同表達時，也能誘導非融合性細胞間(如成纖維細胞)發(fā)生融合[1,8,9]。然而目前和協(xié)同調(diào)控細胞融合的機制還有待深入研究。本文綜述了和在成肌細胞融合方面的最新進展，為研究骨骼肌形成的分子機制提供理論依據(jù)，同時也為治療細胞融合相關(guān)疾病提供一定思路。

1 骨骼肌形成過程

1.1 骨骼肌形成

骨骼肌是機體的重要組成部分[10]，由多核肌纖維彼此緊密排列構(gòu)成。骨骼肌形成包括前體細胞招募、成肌細胞分化、單核肌細胞融合等。在胚胎骨骼肉發(fā)育過程中，PAX7+前體細胞 (肌源性干細胞) 被招募為成肌細胞，然后增殖和分化，最后彼此融合或與現(xiàn)存肌纖維融合形成多核成熟肌管[11]；同樣，當骨骼肌受到外源損傷后，依附于肌纖維基部的靜息肌衛(wèi)星細胞會被激活進而增殖、分化，最終融合形成新肌管以修復肌肉創(chuàng)傷[12]，因此成肌細胞融合是骨骼肌形成的關(guān)鍵步驟。

1.2 成肌細胞融合

成肌細胞融合是一個受到高度調(diào)控的動態(tài)過程，主要涉及細胞骨架重排以及在細胞膜上形成融合孔并交換細胞質(zhì)成分，最終完成細胞融合[13]。Yafe等[14]研究表明，許多調(diào)控因子參與了細胞融合的調(diào)控過程，如MRFs家族(主要包括、、和)，該家族可以與E-box元件結(jié)合，調(diào)控大多數(shù)成肌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。和被認為是肌形成的決定因子，而和在分化后期高度表達，觸發(fā)成肌細胞融合最終形成肌管[15]。目前研究表明，部分細胞粘附蛋白參與了成肌細胞融合過程[16~18]，如Myoferlin是一種在融合細胞膜上高表達的跨膜蛋白，由6個C2結(jié)構(gòu)域(8個β鏈形成的折疊結(jié)構(gòu))和一個羧基端跨膜域構(gòu)成[19,20]，依賴于鈣離子與磷脂結(jié)合[21]。氨基末端的C2結(jié)構(gòu)域(C2 domain of the amino terminus, C2A)突變可以破壞這種結(jié)合，從而降低肌管的融合效率[22]。然而，上述蛋白均是非肌肉特異性蛋白，并且許多蛋白在成肌細胞融合過程中并未發(fā)揮直接調(diào)控作用。因此，研究和揭示直接參與成肌細胞融合的肌特異性膜蛋白成為當前研究熱點。近年來，隨著對和的研究，肌細胞融合過程的調(diào)控機制逐漸清晰(圖1)。

2 成肌過程中Myomaker和Myomerger表達模式

2013年以前，對基因的研究幾乎是空白，直到Millay團隊[5]首次發(fā)現(xiàn)的融合功能并命名為。該團隊通過對小鼠()胚胎進行原位雜交，發(fā)現(xiàn)主要在肌肉組織中特異性表達，提示對骨骼肌發(fā)育的重要性。同時，Zhang等[23]和Landemaine等[24]研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚()快肌(融合能力較強)中高表達，在慢肌(融合能力較弱)中表達量顯著降低；另外，通過qPCR發(fā)現(xiàn)的表達模式類似于和，即在胚胎骨骼肌形成過程中的表達水平明顯高于骨骼肌發(fā)育完成后。2017年，Takei等[25]發(fā)現(xiàn)了另一種膜蛋白GM7325的表達量在激活的肌衛(wèi)星細胞中顯著上調(diào)，暗示對骨骼肌形成的重要作用。同年，Quinn等[9]將命名為，發(fā)現(xiàn)也在肌肉組織中特異性表達，并且在小鼠胚胎發(fā)育過程中和的表達模式類似[5]。骨骼肌生長通常發(fā)生在胚胎期和成年肌肉再生期兩個階段。對此，Millay等[7]為了研究在骨骼肌再生過程中的表達情況，向成年小鼠骨骼肌注射心臟毒素(cardiotoxin, CTX)使之損傷再生，結(jié)果顯示當骨骼肌受到損傷刺激時，處于靜息期的肌衛(wèi)星細胞被迅速激活，同時的表達量顯著上升進而促進細胞融合、修復損傷；在C2C12細胞水平，和在細胞分化和融合過程中的表達量逐漸上升，在分化末期則迅速降低。另外，He等[26]通過免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)Myomaker和Myo-merger蛋白表達模式與其mRNA相似，該結(jié)果在斑馬魚[23,24]和雞()[27]中再次得到了驗證。雖然和的功能性表達在小鼠、斑馬魚和雞中相似，但是其物種保守性仍有待在更多物種中研究確定。

圖1 Myomaker和Myomerger研究進展

3 Myomaker和Myomerger的功能域

3.1 Myomaker蛋白定位及結(jié)構(gòu)

隨著基因注釋研究的不斷完善，目前一些常見物種，包括人()[28]、小鼠[5-9,25,29]、斑馬魚[23]、雞[27]的和基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析(表1)，但對于蛋白功能研究還相對滯后。Gamage等[30]通過設計兩種不同定位的Myomaker抗體，發(fā)現(xiàn)Myomaker不僅定位于細胞膜，也存在于高爾基體和囊泡，這揭示Myomaker在細胞中的精確定位及其潛在的細胞間轉(zhuǎn)運功能。另外，Millay等[6]通過免疫熒光染色(immunofluorescence, IF)發(fā)現(xiàn)Myomaker具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域 (含胞外N端和胞內(nèi)C端)，且Myomaker最后7個氨基酸(氨基酸215~221)的缺失會抑制細胞融合；Gamage等[30]通過對Myomaker C端分析，發(fā)現(xiàn)Myomaker蛋白含有3個保守的棕櫚?；腚装彼?，其可能參與調(diào)控高爾基體轉(zhuǎn)運(圖2A)。綜上所述，這些研究將有利于進一步解析和闡釋成肌細胞的融合機制。

表1 常見物種Myomaker和Myomerger基因結(jié)構(gòu)

圖2 常見物種Myomaker和Myomerger蛋白序列對比

A：常見物種Myomaker蛋白序列對比。TM1-7：7個跨膜區(qū)域；紅色序列：具有促進細胞融合功能；紅色下劃線序列：棕櫚?；腚装彼?；小鼠、人、斑馬魚和雞在UNIPROT中的ID號分別為：Q9D1N4、A6NI61、Q6IQ69和G3RFK8。B：常見物種Myomerger蛋白序列對比。小鼠、大鼠、人、斑馬魚和雞在UNIPROT中的ID號分別為Q2Q5T5、D4A557、A0A1B0GTQ4、P0DP88和G3RUY6。

3.2 Myomerger蛋白結(jié)構(gòu)

相比于Myomaker，目前對Myomerger的結(jié)構(gòu)研究還較少。研究發(fā)現(xiàn)，Myomerger含有多重螺旋區(qū) (圖2B)，其中N端疏水區(qū)域(氨基酸5~25)可能具有跨膜結(jié)構(gòu)。Bi等[1]通過免疫共沉淀(Co-immu-noprecipitation, Co-IP)分析表明，Myomerger N端第一個α-螺旋域內(nèi)帶正電的精氨酸能顯著影響細胞融合能力。同時，Leikina等[31]通過免疫印跡(Western blot)證實Myomerger在細胞表面表達，且通過異源融合實驗表明能顯著促進成肌細胞與成纖維細胞完全融合，但具體作用仍需進一步研究。

4 Myomaker和Myomerger對細胞融合的影響

4.1 Myomaker和Myomerger促進細胞完全融合

在成肌細胞分化過程中，和的表達量逐漸增加，在分化末期，其表達量顯著降低，這種峰值表達模式暗示和可能在細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。對此，Millay等[6]和Quinn等[9]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別將小鼠和敲除后，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白的缺失能顯著抑制成肌細胞融合，該結(jié)果同樣在雞[27]和斑馬魚[32]中也得到了驗證。然而，和敲除后均檢測到(分化標志基因)的表達，說明和并不直接影響細胞分化，而是調(diào)控細胞融合。一直以來，被認為能有效促進肌源性細胞融合。能賦予非融合細胞融合能力，即也能促進非融合細胞如成纖維細胞與成肌細胞融合。但不能促進非肌細胞間的融合，即使過表達后，成纖維細胞間不能發(fā)生融合，由此暗示其他因子可能參與非肌細胞間發(fā)生融合。近來研究發(fā)現(xiàn)，共表達和的成纖維細胞在數(shù)小時內(nèi)開始融合，最終形成巨大的合胞體[1,8]，表明和能協(xié)同作用促進非肌細胞完全融合。

4.2 Myomaker和Myomerger獨立調(diào)控成肌細胞融合的不同階段

近年來，和協(xié)同促進細胞融合的機制逐漸得到解析。Bi[1]和Millay等[5]研究發(fā)現(xiàn)，和敲除的小鼠胚胎表現(xiàn)出相似表型，但這些表型卻存在細微差異，例如在胚胎17.5天，敲除小鼠的肌細胞排列更緊密，暗示和在融合過程中可能發(fā)揮著不同功能。Leikina等[31]發(fā)現(xiàn)和調(diào)控成肌細胞融合和骨骼肌形成，但其結(jié)構(gòu)卻與傳統(tǒng)的融合蛋白不同；免疫印跡結(jié)果證明主要在細胞表面表達，并作用于胞外應力膜；異源融合實驗表明能獨立于促進融合完成，并且和間的物理交互作用并不是其功能所必需的；通過雙標記探針發(fā)現(xiàn)主要參與膜半融合 (即雙層膜中僅一層發(fā)生融合)，而主要促進融合孔形成 (即雙層膜均發(fā)生融合，為胞質(zhì)交換提供有利條件)?？傊?，成肌細胞融合是一個逐步完成的過程，其中和獨立調(diào)控成肌細胞融合的兩個不同階段[31]：第一階段，促進半融合形成，而并未發(fā)揮調(diào)控作用；第二階段，作用于細胞膜，產(chǎn)生膜應力，以獨立于的方式促進完全融合，最后形成多核的合胞體。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)一些因子(如：Octyl glucopyranoside和magainin 2)能彌補的缺失進而促進細胞融合[31]，這將為治療肌肉相關(guān)疾病提供一定參考，但和是如何驅(qū)動半融合向完全融合轉(zhuǎn)變?nèi)杂写M一步研究。

5 Myomaker、Myomerger及其相關(guān)因子對成肌細胞融合過程的調(diào)控機制

5.1 參與成肌細胞融合的調(diào)控因子

成肌細胞融合主要涉及3個關(guān)鍵步驟：首先成肌細胞彼此識別并粘附在一起，其次細胞膜的脂質(zhì)雙層發(fā)生重排形成融合孔，最后融合孔擴張形成合胞體并出現(xiàn)多核肌管。在這些復雜的過程中，除了Myomaker和Myomerger這兩種肌肉特異性蛋白參與調(diào)控外，還有許多其他因子參與其中(圖3)。例如一些免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, Ig superfamily)被證實參與了成肌細胞融合過程[33]。Srinivas等[34]利用嗎啉代(morpholino)介導的敲除實驗，發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎中和基因缺失會導致更短的肌管形成，暗示它們在成肌細胞融合過程發(fā)揮著重要作用。Powell等[35]研究表明，細胞黏附分子Jamb和Jamc突變會抑制斑馬魚胚胎中成肌細胞融合，從而形成單核的胚胎肌纖維。同樣，另一種蛋白Cadherins被認為在細胞融合中發(fā)揮著黏附分子的作用[36,37]，但具體的重要作用還有待進一步研究。在C2C12細胞分化過程中，Zhang等[8]對Myomerger進行免疫沉淀質(zhì)譜分析(IP-mass spect-rometry)發(fā)現(xiàn)了許多具有注釋功能的蛋白。例如Ferlin家族成員，該基因突變會導致遺傳性肌營養(yǎng)不良。Cárdenas等[38]發(fā)現(xiàn)在與細胞融合相關(guān)的過程中(如膜修復、囊泡轉(zhuǎn)運和胞吐)具有調(diào)控作用。De等[39]研究表明基因缺失能明顯抑制成肌細胞融合，但具體的調(diào)控機制仍有待深入研究。

近年來還發(fā)現(xiàn)了另一個調(diào)控成肌細胞融合的潛在途徑，即磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)與其受體BAI1[40]或Stability-2[41]結(jié)合，BAI1或Stability-2通過ELMO/Dock1通路激活Rac1，進而調(diào)控細胞膜重排。Kim等[42]和Jeong等[43]研究發(fā)現(xiàn)，PS可轉(zhuǎn)移到胞外且可以作為直接促進細胞融合的信號。BAI1和Stability-2作為一種膜蛋白，其作用機制與Myo-maker和Myomerger類似，但敲除和具有胚胎致死性，而或缺失對肌肉損傷則相對溫和[40,41]，但具體機制還需進一步研究。

5.2 Myomaker和Myomerger對成肌細胞融合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制

研究表明，參與調(diào)控成肌細胞融合的和主要受MRFs和一些非編碼RNA調(diào)控。Luo等[27]對鳥類成肌細胞研究發(fā)現(xiàn)，在分化過程中，和可直接與啟動子結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。研究表明，miRNAs在骨骼肌分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[44~46]，例如：miR-1能促進骨骼肌成肌細胞分化[47]；miR-133促進細胞增殖但抑制肌源性基因的表達[47]；miR-206在骨骼肌中高表達，但其作用還有待研究[48]。Luo等[27]研究表明，miR-140-3p與3′-UTR靶向結(jié)合從而抑制鳥類表達及成肌細胞融合，暗示可能是miRNAs調(diào)節(jié)骨骼肌分化的關(guān)鍵因子。另外，He等[26]對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，miR-491能與3′-UTR特異性結(jié)合使表達下調(diào)。過表達miR-491能顯著抑制肌肉細胞分化和成年肌肉損傷后再生，而抑制miR-491表達則能促進肌管分化，因此，miR-491可作為一種新的肌源性分化負調(diào)控因子通過靶向影響成肌過程。Ke等[49]研究發(fā)現(xiàn)，在鵝()的胸肌和腿肌中與表達具有負相關(guān)的miRNAs有4個，包括miR-125b-5p、miR-15a、miR-16-1和miR-23。雙熒光素酶報告基因檢測(dual-Luciferase Reporter Gene Assay)發(fā)現(xiàn)只有miR-16-1能直接靶向，表明miR-16-1可能是影響的潛在因素，但進一步的功能研究有待進一步被驗證?？傊琈yomaker和Myomerger是控制肌細胞融合的重要蛋白，同樣受到MRFs和一些非編碼RNA調(diào)控，因此，進一步完善和的上下游調(diào)控網(wǎng)絡有利于深入解析肌細胞融合過程及潛在機制。

圖3 Myomaker、Myomerger及其相關(guān)因子對成肌細胞融合過程的調(diào)控機制

A：多種調(diào)控因子參與細胞膜的黏附及并排過程；B：促進半融合發(fā)生；C：促進融合孔形成；D：細胞融合形成多核的合胞體。？：代表潛在調(diào)控機制。

6 結(jié)語與展望

近年來，和已成為研究成肌細胞融合的“明星分子”。Fineman-Ziter綜合征[28]和(Duchenne muscular dystro-phy, DMD) 是兩種由成肌細胞融合受阻導致的遺傳性肌肉疾病。和能使受損肌纖維的成肌細胞再次發(fā)生融合從而修復骨骼肌損傷，這不僅為研究骨骼肌再生的分子機制提供理論依據(jù)，也可為臨床上治療骨骼肌萎縮等相關(guān)疾病提供思路。雖然治療肌營養(yǎng)不良癥可通過外源細胞融合來促進新肌纖維形成[50,51]，但這種方法所形成的肌纖維融合率極低，恢復肌肉功能也是難以實現(xiàn)。近年來和的發(fā)現(xiàn)為提高肌纖維融合率提供了新思路。和在細胞水平上能顯著提高融合能力，從而誘導多核肌纖維形成。另外，過表達可以促進一些非肌源性細胞(如成纖維細胞)與骨骼肌在體內(nèi)發(fā)生融合[52]，由此為治療骨骼肌損傷相關(guān)疾病提供新策略。對于肉用動物，其肌肉的良好生長發(fā)育關(guān)系到其本身健康和經(jīng)濟價值。由于肌纖維的組織學特征是決定肉質(zhì)性狀指標的關(guān)鍵因素[53]，因此和促進多核肌纖維形成的潛能也有助于改善畜禽肉用性能。目前已發(fā)現(xiàn)在雞、鵝等農(nóng)業(yè)動物骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，對此通過研究和對成肌細胞融合的影響機制，可為研究肌肉品質(zhì)提供一定程度的理論依據(jù)，從而推動畜禽肉用品質(zhì)的改善。

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Molecular regulation mechanism ofandin myoblast fusion

Yan Zhu1, Jinwei Zhang1, Jing Qi1, Xuewei Li1, Lei Chen2, Mingzhou Li1, Jideng Ma1

Myogenesis is a complex physiological process that is mainly involved in the proliferation of myogenic stem cells to form myoblasts, which then differentiated and fused to form multinucleated myotubes. Many proteins have been found to be involved in myoblast fusion, but none of them are muscle-specific fusion proteins. In recent years, two muscle-specific transmembrane proteins, i.e. Myomaker and Myomerger, have been discovered and identified, which can coordinate and promote the fusion of myoblasts and thus participate in the process of myogenesis. In this review, we summarize the research progress ofandin myogenesis, including their expression patterns and functional domains, as well as their participation in myoblast fusion mechanisms, aiming to provide relevant ideas for in-depth study of the myogenesis process and treatment of diseases related to myoblast fusion.

myogenesis;;; myoblast fusion

2019-08-08;

2019-10-25

四川省省院省?？萍己献餮邪l(fā)項目(編號：2017JZ0025)，四川省科技支持計劃項目(編號：2016NYZ0042，2017NZDZX0002)，重慶市農(nóng)業(yè)發(fā)展基金會項目(編號：12404，17430)和四川省科技廳重點研發(fā)項目(編號：2019YFN0035)資助[Supported by Research and Development Project of Scientific and Technological Cooperation between Sichuan Provincial Colleges and Universities (No. 2017JZ0025), the Science and Technology Support Program of Sichuan (Nos. 2016NYZ0042, 2017NZDZX0002), Chongqing Agricultural Development Foundation (Nos. 12404, 17430) and the Key Research and Development Projects of Sichuan Science and Technology Department (No. 2019YFN0035)]

朱艷，碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: zhuyan_494062079@163.com

馬繼登，博士，副教授，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: jideng.ma@sicau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-232

2019/11/28 13:30:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20191127.1143.002.html

(責任編委: 趙要風)