金果欖種子特性及不同沙藏方式促進發(fā)芽的研究

薛襟祺?。停铮瑁幔恚恚幔? Ｍｕｒｔａｚａ Ａｌａｍｉ　王學奎　劉三波　龔達林　王雪松

摘要：為了解金果欖（Tinospora sagittata Gagnep）種子的生理特性和萌發(fā)、生長特性，分別用鮮果實和鮮種子進行沙藏處理后，對野生金果欖果實、種子和胚形態(tài)結構進行了觀察;用含5 mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)、沙藏2個月和4個月對金果欖種子進行無菌發(fā)芽試驗。結果表明，室溫（日夜溫差>10 ℃）濕潤沙藏可打破金果欖種子休眠，促進種子萌發(fā)，保持種子活力;赤霉素處理能快速打破種子休眠，15 d后發(fā)芽率達到80%以上;金果欖種子經(jīng)風干后2個月、4個月的發(fā)芽率分別為20%和10%，表明金果欖種子不適合干燥貯藏。因此，金果欖的休眠類型主要是由于萌發(fā)抑制物存在而導致的生理休眠。

關鍵詞：金果欖（Tinospora sagittata Gagnep）;種子休眠;沙藏;赤霉素;幼苗生長

中圖分類號：S567? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）22-0134-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.031? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on seed characteristics of Tinospora capillipes Gagnep and promotion of germination under the different sand storage ways

XUE Jin-qi1，Mohammad Murtaza Alami1，WANG Xue-kui1，LIU San-bo2，GONG Da-lin2，WANG Xue-song1

（1.College of Plant Science & Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China;

2.China Resources Sanjiu （Huangshi） Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huangshi 435000，Hubei，China）

Abstract： In order to study the seeds physiological property， germination and seedlings growth characteristics of Tinospora capillipes Gagnep， the morphological structure of fruits， seeds and embryos were observed. Fresh seeds were cultured on MS medium added 5 mg/L gibberellin （GA）， other seeds which were preserved in sand for two and four months were cultured on MS medium without plant growth regulator for germination. The results showed that sand storage of fresh fruits and seeds in room（temperature difference between day and night>10 ℃） could break the dormancy of Tinospora capillipes Gagnep， promote the germination， and keep the seed vigor. Gibberellin treatment could break the seed dormancy effectively， and the germination rate was more than 80% after 15 d. The germination rate of the air-dried seeds after 2 months and 4 months were 20% and 10%， respectively. Therefore， the seeds of Tinospora capillipes Gagnep are not suitable for storage after air-dried. In conclusion， seeds of Tinospora capillipes Gagnep have dormant characteristics mainly because of germination inhibitor in endosperm.

Key words： Tinospora capillipes Gagnep; seed dormancy; sand storage; gibberellin; seedlings growth

金果欖是防己科青牛膽屬植物青牛膽（Tinospora sagittata Gagnep）或金果欖（Tinospora capillipes Gagnep）的地下球狀塊根，別名山慈菇、地苦膽、金獅藤。中國金果欖的基源植物主要為青牛膽、云南青牛膽和峨眉青牛膽[1]，分布在秦嶺以南至中南半島，主產(chǎn)于四川、貴州、廣東和廣西。金果欖味苦性寒，具清熱解毒、通氣道、調火路、清肝明目的功效[2]，也有報道表明，其“能祛內外結熱，遍身惡毒，消瘴癘，止齒痛”[3]。金果欖是苗族、侗族、瑤族等少數(shù)民族的習用藥物，臨床上用于治療咽喉腫痛、發(fā)炎發(fā)熱和上呼吸道感染等疾病[4]。

近年來，隨著金果欖藥材價格的升高，野生資源遭到掠奪式采挖，其資源和生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞。因此，為保障金果欖原料的持續(xù)供給，開展野生撫育和人工栽培是解決金果欖資源可持續(xù)發(fā)展的必由之路。由于金果欖藥材長期依賴野生資源，目前對于金果欖植物的生長發(fā)育特性了解甚少。野生金果欖自然狀態(tài)下結實不多，給金果欖的資源擴繁帶來了較大障礙。潘麗梅等[5]和李小泉等[6]利用組織培養(yǎng)探索了金果欖葉腋處芽的萌芽和生根情況，對金果欖的扦插繁殖具有一定參考價值。但目前有關金果欖的有性繁殖器官種子的特征、特性了解不多，關于金果欖種子的繁殖技術研究鮮見報道。本研究以采集的野生金果欖果實為材料，探討金果欖種子的形態(tài)特征、生理特性以及不同保存方式對其萌發(fā)的影響，以期為金果欖種苗繁育提供技術支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗所用的野生金果欖果實于2017年10月在湖北省西南部山區(qū)采集，并經(jīng)過實地鑒定為防己科青牛膽屬植物。

1.2? 試驗設計

將采集的野生金果欖果實分成3份，其中1份用流水沖洗果實表面后作為鮮果備用;另外2份經(jīng)揉搓去掉果皮、果肉后用流水沖洗干凈，1份作為鮮種子備用，另1份裝入尼龍網(wǎng)袋懸掛于通風處陰干，作為干種子備用。

1）金果欖鮮果和鮮種子沙藏處理。將河沙過篩后，選取直徑約0.5 mm的河沙，經(jīng)流水漂洗后，瀝干水分至沙粒濕度達到40%左右，即手握成團、落地即散的狀態(tài)。事先在長、寬、高分別為30、20、8 cm的白色塑料盆中鋪設高約4 cm的濕沙，分別將金果欖鮮果和鮮種子均勻擺放在沙面上，果實和種子上面再蓋上3～4 cm的濕沙。每個塑料盆上覆蓋2層吸水性強的濕潤毛巾，及時補充水分以保持河沙濕度。沙藏處理于2017年10月17日開始，沙藏的果實和種子置于室內自然通風條件下，沙藏鮮果的處理記為FS，沙藏鮮種子的處理記為SS，每種沙藏方式設置3次重復。7 d后每2 d觀察發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽時間，并統(tǒng)計發(fā)芽率。

種子沙藏60 d后，移入河沙和營養(yǎng)土（1∶3，? V/V）的混合基質中，置于（25±2） ℃的溫室中進行培養(yǎng)，光暗循環(huán)時間為12 h/12 h，平均光照強度? 18 000 lx。分別記錄相應沙藏處理下金果欖幼苗生長至一葉期、二葉期和三葉期需要的天數(shù)，用直尺測定三葉期時的株高和主根長。

2）金果欖種子無菌發(fā)芽試驗。將鮮種子去掉種皮后用0.1%的氯化汞消毒3 min，接入含5 mg/L GA的MS培養(yǎng)基中，記為GA，在不添加GA的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽作為對照（CK）;另將干藏2個月和4個月的干種子在去離子水中浸泡至恒重，去掉種皮后，分別接種在不含GA的MS培養(yǎng)基中進行無菌萌發(fā)試驗，其處理分別記為SD2和SD4。每個培養(yǎng)瓶中接入20粒種子，每處理3次重復。光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，相對濕度為50%。

1.3? 測定指標與方法

1）種子發(fā)芽率測定。沙藏處理的種子，7 d后每隔2 d觀察、記錄種子的發(fā)芽數(shù)，無菌萌發(fā)試驗每天觀察、記錄種子的發(fā)芽數(shù)。種子發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

2）金果欖果實和種子形態(tài)特征觀察。取鮮果和鮮種子，在體式顯微鏡下觀察果皮、種皮形態(tài)，將種子切削后觀察種仁和胚的形態(tài)特征。

3）金果欖種子吸水特性測定。將風干種子分成2組，1組保留完整種皮（有種皮），另1組剝去外種皮（去種皮），各取完整種子20粒，稱其總質量后，放入燒杯中，加入相當于種子質量10倍的去離子水，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中，間隔2 h取出，用吸水紙吸干種子表面水分后稱其總質量，計算種子不同時間下的吸水百分率，各3次重復。

4）株高和根長測定。用直尺測定株高和根長，株高為根莖連接處到頂芽的高度，根長為根莖連接處到主根末端的長度。

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用Excel 2017軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2? 結果和分析

2.1? 金果欖果實和種子的形態(tài)特征

野生金果欖的果實生長在葉腋處，果實球形，有果柄，成熟時粉紅色，從果實著生情況可見其花序為總狀花序（圖1a）。金果欖果實為核果，果皮薄，果肉多汁，具甜味。果實球形，成熟果皮粉紅、表面光滑、有光澤，平均直徑為8.5 mm（圖1b）。去除果皮、果肉后，金果欖種子呈半球形，直徑約為5.7 mm，腹面向內凹陷（圖1c）。金果欖種子的鮮、干質量分別為每千粒53.20、40.36 g，可見成熟后的金果欖鮮種子含水率相對較低，為24.14%。外種皮革質化，表面有點狀凸起，背面脊線為種脊，種子一端隆起（圖1d）。將種子縱切后，可以看到種子結構從內到外依次是外種皮（革質）、內種皮（膜質）、胚乳和胚，胚根、胚軸和子葉可明顯看到，而胚芽不明顯，整個胚嵌合在胚乳中間，胚根在胚乳有尖狀凸起的一端（圖1e）。將外種皮去掉后，內表皮膜質，薄且透明，胚乳白色（圖1f），腹部有明顯凹陷（圖1g）。將金果欖外層胚乳去除，可以看到具有兩片子葉，中部部分重疊，緊貼在胚乳上，與胚軸相連（圖1h）。

2.2? 金果欖種子的吸水特性

圖2為干燥的金果欖完整種子和去種皮種子在25 ℃下的吸水量曲線。整體來看，金果欖去種皮種子的吸水量明顯大于有種皮的完整種子，在57 h內的吸水量達到62%，比完整種子此時的吸水量46%相對增加了16個百分點。而在浸種的最初4 h內，有種皮的完整金果欖種子的吸水量明顯高于去種皮的，但這一時期的總吸水量不高，小于10%;浸種4 h之后，去種皮的金果欖種子的吸水量明顯高于完整種子，浸種47 h后，兩者的吸水量均達到最大值，一直到浸種后57 h，吸水量曲線均呈直線，顯示此時期為干燥金果欖種子的吸水停滯期。

從有、無種皮的金果欖種子浸種到吸水停滯期的出現(xiàn)均需要約47 h，一方面說明金果欖種子吸水較慢，另一方面表明金果欖種子的革質化種皮雖然堅硬，但透水性并不差。有種皮的完整種子在浸種初期（4 h內）吸水量和吸水速度高于去種皮的種子，與其種皮的親水力有關，一方面是干燥種皮吸水較快，起到軟化種皮的作用，另一方面是短時間水分充滿干種子外種皮和內種皮之間的間隙;而浸種4 h之后完整種子的吸水量和吸水速率明顯低于去種皮的，反映出金果欖種子的堅硬種皮影響其胚乳吸水。達到吸水停滯期時，去種皮種子吸水量約為完整種子的1.3倍，說明革質化種皮在一定程度上阻礙了種子吸水。

2.3? 沙藏對金果欖果實和種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表1可知，金果欖鮮果沙藏處理（FS）的發(fā)芽時間，達到一葉期、二葉期和三葉期的時間均晚于鮮種子沙藏處理（SS），分別晚6.2、5.1、9.2、11.2 d，差異均顯著。鮮果沙藏處理的發(fā)芽率比鮮種子沙藏的高，兩者之間的差異顯著。從幼苗的生長量來看，鮮果沙藏處理的幼苗在三葉期時株高和主根長均小于鮮種子沙藏處理，分別只有種子沙藏處理的68.4%和79.0%，差異均顯著。

圖3a和圖3b分別為金果欖鮮果和鮮種子沙藏50 d的形態(tài)。兩者胚根長度相比，金果欖鮮種子沙藏的發(fā)芽速度明顯快于鮮果沙藏。金果欖種子萌發(fā)時胚根首先突破種皮，進行伸長生長（圖3a）;胚根伸長到一定程度時，胚芽從胚軸與子葉連接處伸出（圖3b）。圖3c和圖3d分別為鮮果和鮮種子沙藏60 d后，再移栽至溫室生長80 d后的幼苗。可以看到，金果欖幼苗在二葉期時種子尚未掉落（圖3c），屬于子葉留土植物。三葉期時種子已經(jīng)脫落（圖3d），幼苗完全進入自養(yǎng)階段，因此，三葉期是金果欖幼苗由異養(yǎng)轉入自養(yǎng)的時期。鮮種子沙藏后，其萌發(fā)形成的金果欖幼苗的葉片數(shù)、株高和根長均大于鮮果沙藏處理。由此可見，成熟的金果欖果實以去果皮、果肉后的新鮮種子進行沙藏處理，種子萌發(fā)快，幼苗生長更為迅速。從金果欖種子胚根伸出到幼苗第一片真葉展開所需時間約為45 d，胚芽在胚根伸長到1～2 cm之后伸出（圖3b），表明胚芽伸長和出土所需時間較長。

2.4? 金果欖干、鮮種子在無菌條件下的萌發(fā)特性

由圖4可知，在含有5 mg/L GA的MS培養(yǎng)基上，金果欖鮮種子的發(fā)芽率達到80%以上，沒有添加GA作為對照的種子發(fā)芽率只有20%;干藏2個月、4個月后的金果欖種子在MS培養(yǎng)基上發(fā)芽率分別為20%和10%。在無菌萌發(fā)試驗中，與對照相比，GA處理可明顯提高金果欖種子的發(fā)芽率，比不添加GA的種子發(fā)芽率高4倍。

在培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)添加GA后，種子培養(yǎng)8 d后開始萌發(fā)，15 d后發(fā)芽率達到75%，而對照（CK）在培養(yǎng)9 d后種子開始萌發(fā)，15 d后發(fā)芽率僅為20%，表明GA能明顯提高金果欖種子萌發(fā)的速度和整齊度。

3? 討論

通常藥用植物的種子具有不同程度的休眠，有利于適應野外的不良環(huán)境，以保證在野生環(huán)境下物種種群數(shù)量的延續(xù)[7]。然而，野生植物的休眠造成了野生資源人工開發(fā)和利用的困難，而且若種子保存不當，則導致種子活力降低，甚至完全喪失生活力。

形態(tài)觀察結果表明，金果欖種子結構類似于蓖麻種子，屬雙子葉有胚乳種子，具有兩層種皮，外種皮革質化，內種皮膜狀，胚包裹在胚乳之間，子葉膜質并與胚乳貼合在一起，是植物界中少見的類型。成熟金果欖種子的胚基本發(fā)育完全，但胚芽很小，不能明顯看到，隱藏在胚軸與子葉連接處。彭木等[8]使用不同溫度（4、25、60、80 ℃），不同藥劑（6-BA、NAA、GA、HgCl2）對蓖麻種子進行處理，發(fā)現(xiàn)4 ℃和50 mg/L GA處理后，其發(fā)芽率分別達到71.6%和90.0%，與本試驗得到的結論相似。

本試驗比較了自然條件下濕潤沙藏和干藏2種貯藏方式對金果欖種子萌發(fā)的影響。結果發(fā)現(xiàn)，金果欖完整鮮果以及去除果皮果肉后的新鮮種子經(jīng)沙藏后的發(fā)芽率均超過85%，而種子風干后保存2個月、4個月后的發(fā)芽率只有20%和10%。因此，金果欖種子采收后應及時沙藏，以確保發(fā)芽率。胡茶青[9]研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳種子室外沙藏發(fā)芽率為94%，干藏后僅為49%。濕潤沙藏也適用于玉竹[10]、黃檗[11]等其他藥用植物種子的保存。

沙藏過程中，溫度條件對種子萌發(fā)影響較大。在本試驗中，金果欖種子的沙藏過程在自然條件下完成，沙藏期間的晝夜溫差大于10 ℃，能保持金果欖種子的良好活力。張國珍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，凹葉厚樸種子在自然條件沙藏的發(fā)芽率（98.4%）遠高于低溫冷藏（34.0%）。本試驗因采集的種子數(shù)量有限，未進行梯度恒溫試驗，有待后續(xù)研究。此外，本試驗結果發(fā)現(xiàn)，鮮果沙藏處理的發(fā)芽率高于種子沙藏，但種子沙藏處理的平均發(fā)芽時間比鮮果沙藏處理的短6.2 d。這與王占紅等[13]對黃精種子進行沙藏處理的結果相似。說明保留金果欖果實的果肉有利于保證其種子的發(fā)芽率，但種子的平均發(fā)芽時間會延長一周左右。金果欖種子胚根伸出較長時，胚芽才開始伸長，從發(fā)芽到幼苗一片真葉展開所經(jīng)歷的時間超過40 d，可能與金果欖種子的胚芽小或是胚芽未完全發(fā)育有關。

赤霉素是打破種子形態(tài)休眠和生理休眠的常用調節(jié)劑。劉恒等[14]用100 mg/L的赤霉素處理金銀花種子12 h，顯著提高了金銀花種子的發(fā)芽率。苗利娟等[15]用100 mg/L的赤霉素處理懷山藥零余子，有效破除了休眠。本試驗表明，赤霉素能夠顯著提高金果欖種子的發(fā)芽率和萌發(fā)整齊度，一方面可能是解除了萌發(fā)抑制物的抑制作用，并促進胚根迅速伸長，另一方面可能是赤霉素誘導降解胚乳養(yǎng)分有關酶的合成，促進了胚對營養(yǎng)物質的吸收，促使種子胚芽的發(fā)育。因此，金果欖種子的休眠類型主要為生理休眠類型，可能也存在因胚芽未發(fā)育完全有關的形態(tài)休眠。

通過沙藏或赤霉素處理2種方式可以有效破除金果欖種子的休眠，且赤霉素打破其休眠的速度更快。金果欖種皮不阻礙種子對水分的吸收，但其革質化的外種皮對種子的后期吸水有阻礙作用。因此，金果欖休眠類型主要為萌發(fā)抑制物引起的生理型休眠。

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