暴雨后疑難檢材DNA 檢驗方法探討

章冬青，葉 娟，貢楊政

（安徽省天長市公安局，安徽 天長 239300）

一、案情

2019 年6 月2 日15 時許， 安徽某市某鎮(zhèn)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)一名中年男性死亡， 經(jīng)勘查受害人為林某某，系被人用銳器捅進(jìn)后腰部死亡。 案發(fā)現(xiàn)場（圖1）未發(fā)現(xiàn)疑似兇器和其他可疑物品，辦案單位通過大量走訪發(fā)現(xiàn)死者鄰居錢某，與林某某家因抗旱水源問題積怨頗深，曾多次揚(yáng)言要報復(fù)林某某家人，具有重大作案嫌疑。 但犯罪嫌疑人錢某曾被多次打擊處理，具有一定的反偵察經(jīng)驗，審訊期間情緒亢奮，性格偏執(zhí)，回避交代犯罪事實(shí)。 現(xiàn)場勘查人員對錢某家及周邊進(jìn)行搜索，在農(nóng)田旁發(fā)現(xiàn)一把黃色陶瓷刀（圖2），疑似作案工具。案發(fā)時正值暴風(fēng)雨強(qiáng)對流天氣，檢材遭受暴雨沖洗長達(dá)3 小時之久，這對檢驗人員乃是極大的考驗。DNA 實(shí)驗室技術(shù)人員迎難而上，結(jié)合案情和現(xiàn)場分析，改進(jìn)檢驗提取方法，選擇最佳擴(kuò)增策略，在該重要物證上成功檢出受害人林某某和嫌疑人錢某STR 分型， 從而為案件的起訴、審判增加了一塊重重的砝碼。

二、檢材提取方法

圖1 暴雨過后的案發(fā)現(xiàn)場

圖2 錢某家周邊農(nóng)田旁黃色陶瓷刀

此案的關(guān)鍵在于這把黃色陶瓷刀，如果此刀確為犯罪嫌疑人作案后所留，必然有嫌疑人和受害人DNA殘留。 但是當(dāng)日暴風(fēng)雨強(qiáng)對流天氣，已將刀上血跡沖洗干凈，肉眼無法分辨。 DNA 技術(shù)人員與現(xiàn)場勘查人員積極溝通，縝密研判后，決定采用兩步擦拭法分別擦拭刀柄、刀刃和刀套部位，以防大面積擦拭檢出混合基因分型而無法判型。 兩步擦拭法[1]又稱為干濕擦拭法，適用于質(zhì)地較硬、非滲透性的載體[2]，比如金屬材質(zhì)、塑料、玻璃等。 該案檢材陶瓷刀材質(zhì)較硬，為非滲透性載體，故采用兩步擦拭法，三根干棉簽蘸取少許蒸餾水后，用中等力度對刀柄、刀刃和刀套表面進(jìn)行分段擦拭， 后再取三根干棉簽對三個部位分別進(jìn)行二次擦拭。棉簽折斷后置于三個1.5ml的離心管中。

三、檢驗方法

（一）初次檢驗過程

對刀柄、 刀刃和刀套部位提取的三份擦拭物采用相同檢驗方法，如下：

剝?nèi)「蓾駜筛藓灡韺臃胖迷谠鹊?.5ml 的離心管中，加入500ul 無菌水，采用金標(biāo)抗人血紅蛋白（FOB）檢測試劑條法進(jìn)行檢驗，結(jié)果均為陰性。13000r/min 離心3min，去上清，在收集的沉淀物中加入200ul 5% Chelex-100 溶液（5% Chelex-100 為懸濁液， 使用前要振蕩懸浮聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂顆粒），56℃保溫30min 或更長時間，漩渦振蕩7s，100℃保溫8min 后， 劇烈振蕩7s，13000r/min 離心3min，上清液直接用于PCR 分析。

使用Identifiler?Plus 試劑盒 （美國Thermo Fisher 公司）進(jìn)行復(fù)合熒光STR 試劑擴(kuò)增，10ul 擴(kuò)增體系，模板DNA 量為2.0ul，Mix 4.0ul，Primer 2.0ul，H2O 2.0ul，Veriti 擴(kuò)增儀（美國Thermo Fisher 公司）擴(kuò) 增，PCR 熱 循 環(huán) 參 數(shù) 為：95℃11min，94℃20s，59℃3min，28 個循環(huán)，60℃延伸10min，4℃保溫。 分別取擴(kuò)增產(chǎn)物1.0uL 與去離子甲酰胺10uL、LIZ 600 0.25uL 混合，應(yīng)用ABI-3500XL 型DNA 序列分析儀（美國Thermo Fisher 公司） 電泳分離和激光掃描分析。 采用GeneMapperID-X 軟件進(jìn)行STR 分析。

STR 分型結(jié)果

刀柄檢出混合STR 分型（圖3），基本包含該案受害人林某某基因型（圖4），刀刃和刀套上未檢出STR 分型。

（二）再次檢驗過程

再次對檢材刀柄、刀刃和刀套表面進(jìn)行擦拭，重點(diǎn)擦拭泥土覆蓋部位， 棉簽剪碎后放入1.5ml 離心管中，加入ATL 裂解液300ul，蛋白酶K 30ul，56℃消化3 小時， 取上清液， 用MinElute 離心柱在QIAcube 純化儀上提取、 純化， 洗脫體積設(shè)定為20uL。

圖3 刀柄擦拭物混合STR 分型圖

圖4 林某某血樣STR 分型圖

STR 分型結(jié)果

刀柄上檢出單一男性STR 分型（圖5），與受害人林某某基因型相同，刀套上檢出另一男性STR 分型（圖6），與嫌疑人錢某基因型（圖7）相同，刀刃上未檢出人DNA。

四、結(jié)果與討論

DNA 技術(shù)人員在開展檢驗工作前須與現(xiàn)場勘查人員積極溝通， 了解現(xiàn)場物證的原始形態(tài)和原始環(huán)境，方能有針對性地選擇檢驗方法。本案中檢材受到雨水酸堿度、潔凈度、溫度、微生物等因素的影響，細(xì)胞被沖洗、破壞的較多，再加上現(xiàn)場提取環(huán)節(jié)的一些因素，DNA 有部分耗損，往往不易檢出有效結(jié)果。針對該檢材的實(shí)際條件， 技術(shù)人員采用兩步擦拭法分段擦拭， 初次檢驗為后面的二次檢驗提供了較好參考，結(jié)合兩次檢驗圖譜，最終取得有效結(jié)果。

圖5 刀柄擦拭物STR 分型圖

圖6 刀套擦拭物STR 分型圖

圖7 錢某血樣STR 分型圖

作案兇器被暴雨沖洗了長達(dá)3 個小時， 首先采用金標(biāo)抗人血紅蛋白（FOB） 檢測試劑條法進(jìn)行檢驗， 該試紙條是通過把膠體金的顯色作用和免疫層原理相結(jié)合而研制的血液檢測工具，靈敏度較高[3]，法醫(yī)領(lǐng)域常用于血液種屬檢驗。 此案擦拭部位均未檢見人血反應(yīng)，切勿認(rèn)為檢材上已無受害人DNA 殘留，擦拭提取不徹底，或血跡雨水沖洗干凈均會造成FOB 檢驗結(jié)果陰性，但人體組織殘留亦有可能。 初檢后兇器上雖未作出單一的受害人基因型， 但刀柄處檢出混合STR 分型，基本包含受害人林某某基因型，證明了前期組織殘留的想法。兇器上未檢出嫌疑人基因型，不能放棄下步處理檢驗。 作為命案而言，作案兇器都是案件的關(guān)鍵物證之一， 檢材處理應(yīng)當(dāng)慎之又慎，須將檢材檢驗到窮盡。

再次檢驗時， 仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)刀柄及刀套上有很多泥土，那么第一次擦拭檢出的人體DNA 可能包裹在泥土中，泥土可以阻止雨水沖洗，使得DNA 保存下來。再次檢驗時對刀柄、刀套上的泥土部分進(jìn)行重點(diǎn)擦拭提取， 用多個棉簽反復(fù)采集后全部置于同一個試管中，考慮到泥土包裹，會摻入大量的PCR 抑制劑[4]，隨即采用MinElute 離心柱在QIAcube 純化儀上提取、純化，QIA DNA Investigator 試劑盒[5]（德國QIAGEN 公司）、MinElute 離心柱的硅膠膜可高效去除二價陽離子、蛋白質(zhì)、較大顆粒雜志等PCR 抑制劑，載體RNA 進(jìn)一步增強(qiáng)DNA 與硅膠膜的結(jié)合，使DNA 分子特異性地吸附到硅膠膜上，最大限度截留DNA 分子，得到高質(zhì)量的DNA 模板，使PCR 反應(yīng)及電泳分析獲得良好的效果。另外，首次檢驗分析后峰值不高，所以二次檢驗純化后，改善PCR 反應(yīng)條件[6]，擴(kuò)增直接采用最佳擴(kuò)增體系，25ul 擴(kuò)增體系，保證擴(kuò)增的均衡性，適當(dāng)增加模板量，提高檢測靈敏度[7]，電泳分析后成功在刀柄上檢出受害人STR 分型，刀套上檢出嫌疑人STR 分型，刀刃上仍未檢出人DNA。

分析結(jié)果：常規(guī)命案兇器，以刀為例，刀刃處應(yīng)為受害人DNA，刀柄處為嫌疑人DNA，但此案暴雨沖洗時間較長，DNA 檢出位置并非原始位置， 檢驗結(jié)果并無矛盾之處，可作為案件的起訴、審判的重要技術(shù)支撐。

本案檢材條件差，切勿出現(xiàn)思想局限，主觀上就認(rèn)為檢驗效果差也理所當(dāng)然，不再進(jìn)行下步處理。無論大案小案，均應(yīng)同等對待，對于重要案件的重要檢材，處理更應(yīng)慎重，需開拓思維，改進(jìn)檢驗方法。本案中檢材經(jīng)反復(fù)檢驗后效果明顯， 最終得到有效基因分型，為偵查破案提供了直接證據(jù)。