兩種檢測水貂阿留申病毒抗體方法敏感性的比較研究

王振軍，羅國良，易立，郭利，馮二凱，程世鵬，程悅寧

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease，AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus，AMDV）引起的慢性、持續(xù)性傳染病，該病嚴(yán)重影響水貂的毛皮質(zhì)量，損害其生育能力，降低存活率，是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病[1-2]。該病目前仍沒有有效的疫苗來防控，檢測和淘汰阿留申病貂是目前主要防控該病的方法。自該病報道以來，國內(nèi)、外研究人員建立了碘凝集、對流免疫電泳（CIEP）、PCR、間接免疫熒光、ELISA 等諸多診斷方法[3-7]，其中，對流免疫電泳法是目前國際公認(rèn)的水貂阿留申病診斷的黃金法則，但該方法操作步驟繁瑣、耗時等缺陷，阻礙了AMD的檢測在基層的普及和推廣。

近年來，隨著科技進(jìn)步及新型診斷技術(shù)的發(fā)展，對水貂阿留申病的診斷開啟了新的研究思路。水貂阿留申病的膠體金診斷法是近年新興的水貂阿留申病快速診斷方法[8-9]，其檢測簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)收到基層用戶的廣泛好評。本研究對新開發(fā)的水貂阿留申病毒抗體膠體金快速診斷試紙與水貂阿留申病的金標(biāo)準(zhǔn)檢測法―對流免疫電泳法進(jìn)行敏感性對比研究，以比較兩種檢測方法在檢測敏感性方面的差異。

1 材料

1.1 試紙條

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫團(tuán)隊制備。

1.2 血清來源及背景

1.2.1 質(zhì)控血清 水貂阿留申病毒陽性質(zhì)控血清10份，對流免疫電泳效價≥1∶8，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所制備、保存和提供。

1.2.2 田間血清 自然感染田間血清100 份，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所試驗(yàn)動物基地采集，根據(jù)對流免疫電泳檢測結(jié)果，將自然感染血清分為弱陽性（對流免疫電泳效價＜ 1∶8）和陽性（對流免疫電泳效價≥1∶8）。

1.3 對流免疫電泳抗原

由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫團(tuán)隊診斷制品實(shí)驗(yàn)室制備、標(biāo)定、檢測。

1.4 對流免疫電泳相關(guān)設(shè)備

高壓雙穩(wěn)電泳儀 DYY-4C、臥式水平電泳槽DYCP-38C（北京六一儀器廠）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 血清稀釋

2.1.1 陽性質(zhì)控血清 將10 份陽性質(zhì)控血清ADVP1～ADVP10 樣品各1 份，用樣品稀釋液按不同比例進(jìn)行稀釋，控制陽性質(zhì)控血清對流免疫電泳（CIEP）效價1∶8～1∶16，取各個稀釋度的血清5μL 進(jìn)行檢測。

2.1.2 弱陽性質(zhì)控血清的制備 將10 份陽性質(zhì)控血清用樣品稀釋液按不同比例進(jìn)行稀釋，控制陽性質(zhì)控血清對流免疫電泳（CIEP）效價1∶0.125～1∶8，制備檢測用弱陽性質(zhì)控血清。

2.1.3 田間血清稀釋 將對流免疫電泳檢測確認(rèn)的水貂阿留申病毒抗體效價田間血清倍比稀釋，取1∶8～1∶64 稀釋度進(jìn)行試紙條檢測。

2.2 試紙條檢測與判定

取出適量的試紙條，取陽性質(zhì)控血清、弱陽性質(zhì)控血清、田間血清 5 μL 于加樣孔，然后滴加 80 μL 稀釋液（約3 滴），或直接滴加經(jīng)稀釋的血清3 滴，10～15 min內(nèi)讀取結(jié)果并記錄。

3 結(jié)果

3.1 陽性質(zhì)控血清試驗(yàn)結(jié)果

10 份陽性質(zhì)控血清檢測結(jié)果均為陽性反應(yīng)，陽性血清效價在1∶8～1∶16 時，試紙條對陽性血清的檢出率為100%，見表1。

表1 陽性質(zhì)控血清檢測結(jié)果Table 1 Test results of positive quality control serum

3.2 弱陽性質(zhì)控血清試驗(yàn)結(jié)果

用試紙條檢測法和 CIEP 檢測法對10 份水貂阿留申病毒質(zhì)控血清制備的不同稀釋度（1∶8～1∶64）弱陽性血清進(jìn)行檢測，試紙條檢測法對電泳效價范圍在1∶8～1∶16 的血清1∶64 倍以下稀釋時，其陽性檢出率為100%，但隨著稀釋倍數(shù)的提高，試紙條質(zhì)控線顯色呈下降趨勢；CIEP檢測法對稀釋度＜1∶32 的弱陽性樣品的檢測結(jié)果有較高的檢出率，但對稀釋度＞1∶64 的樣品檢測效率明顯下降。結(jié)果見表2、3。

表2 弱陽性質(zhì)控血清試紙條檢測結(jié)果Table 2 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

表3 弱陽性質(zhì)控血清CIEP 檢測結(jié)果Table 3 Results of CIEP detection in weak-positive controlled serum

3.3 田間血清敏感性檢測結(jié)果

對流免疫電泳檢測確認(rèn)的水貂阿留申病毒抗體效價100 份田間血清倍比稀釋后，對1∶8～1∶64 稀釋度進(jìn)行試紙條和CIEP 檢測。結(jié)果顯示，1∶8 稀釋度下試紙條與CIEP 的陽性檢出率均為100%；1∶16 稀釋度下試紙條與CIEP 的陽性檢出率分別為100%、90%；1∶32 稀釋度下2 種方法的陽性檢出率分別為99%、55%，且試紙條多顯示弱陽性條帶，CIEP 法檢出率明顯下降；1∶64 稀釋度下檢測時試紙條陽性檢出率為96%，CIEP 法檢出率僅為23%。結(jié)果見表4。

表4 不同稀釋度田間血清樣品試紙條檢測結(jié)果Table 4 Testing results of field serum samples with different dilution

續(xù)表4

續(xù)表4

圖1 弱陽性質(zhì)控血清試紙條檢測結(jié)果Fig.1 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

4 討論

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條是用來定性檢測水貂阿留申病毒抗體的快速診斷產(chǎn)品，其檢測線（T線）的顯色深淺是隨水貂體內(nèi)阿留申病毒抗體的含量而變化的，阿留申病毒抗體的含量高，則試紙條檢測線顯色深，用“++”表示顯色較深的陽性結(jié)果；阿留申病毒抗體的含量低，則試紙條檢測線顯色淺，“+”表示顯色較淺的弱陽性結(jié)果。

水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條在對不同稀釋倍數(shù)的陽性質(zhì)控血清進(jìn)行檢測時，隨血清稀釋倍數(shù)的增加，試紙條檢測線有逐漸變淺的趨勢，說明隨著抗體的減少，試紙條檢測能力不斷下降；同樣的樣品用CIEP 法檢測結(jié)果顯示，樣品未做稀釋時，陽性質(zhì)控血清檢出率為100%，當(dāng)檢測經(jīng)倍比稀釋的陽性質(zhì)控血清所制備的弱陽性樣品時，CIEP的檢出率隨著稀釋倍數(shù)的增加而下降且產(chǎn)生的沉淀線也變得模糊、不易判讀。對田間樣品檢測結(jié)果再次驗(yàn)證了上述事實(shí)，即CIEP法對檢測未經(jīng)稀釋的樣品或稀釋倍數(shù)＜1∶16 時，其陽性檢出率和試紙條檢測法檢出率相當(dāng)（檢出率≥90%）；當(dāng)檢測樣品的稀釋倍數(shù)＞1∶16 時，CIEP的檢測效率明顯下降且檢測結(jié)果不易判定，不同檢測人員對結(jié)果的判讀容易出現(xiàn)較大誤差，而試紙條檢測法在檢測稀釋度＜1∶64 的樣品時，能保持較高的敏感性，其檢出率＞95%。

根據(jù)上述試驗(yàn)中，用2 種檢測方法對水貂阿留申病陽性質(zhì)控血清及田間血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，傳統(tǒng)的CIEP 檢測方法，在對未稀釋血清樣品檢測時，其陽性檢出率與試紙條檢測法的檢出率一致，但隨著樣品稀釋度的不斷增加，CIEP的檢測效率下降明顯且結(jié)果判定難度增加，判定誤差增加；試紙條檢測法在對稀釋度＜1∶64 的樣品檢測時仍有較高的檢出率。

目前，在世界主要水貂養(yǎng)殖國家，水貂阿留申病的檢測的通用方法依然是CIEP 法，在少數(shù)北歐國家，高通量ELISA 方法檢測水貂阿留申病也有較廣泛的應(yīng)用，這些國家的水貂養(yǎng)殖集約化程度很高，市場成熟度方面我國與之相比還有較大差距；在我國特殊的養(yǎng)殖條件下，水貂阿留申病毒抗體膠體金檢測試紙條有其獨(dú)特的優(yōu)勢，它使用靈活方便，操作簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對大范圍普檢、個體檢測均可靈活應(yīng)用，對比CIEP 法其優(yōu)勢明顯，未來有望替代CIEP 法成為檢測水貂阿留申病毒抗體的主流方法。