參茸鹿胎膏有效成分的定性鑒別及含量測(cè)定

田旭，張紅梅，周微※，侯淑麗

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)春 130021；2.吉林省醫(yī)藥中等職業(yè)學(xué)校，長(zhǎng)春 130031）

膏方又稱膏劑，是中醫(yī)藥的8 種劑型（丸、散、膏、丹、酒、露、湯、錠）之一，它以大規(guī)模復(fù)方湯劑為基礎(chǔ)，經(jīng)濃縮煎煮后加入蜂蜜或阿膠后制成的一種濃稠的半固體劑型。參茸鹿胎膏為棕褐色塊狀物，具有輕微的腥味和略帶咸味的味道，該藥物由人參、當(dāng)歸、川穹、鹿茸、鹿胎、化橘紅、附子（制）等45 種中藥組成，其主要功能為補(bǔ)虛生精、益腎壯陽(yáng)的功效，主治經(jīng)血不足、婦女虛寒。

本組方中的人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的根莖，主要成分是皂苷類、糖類、揮發(fā)油等；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis）的根，主要成分是有機(jī)酸、揮發(fā)油、糖等；川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的根莖，主要含有阿魏酸、川芎嗪等；附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）的子根加工品，主要含有生物堿等，由于含有的烏頭堿類生物堿有毒，因此需要進(jìn)行烏頭堿的限量檢查[2]；化橘紅為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis Tomentosa）或柚〔C.grandis(L.)Osbeek〕的果皮，主要含有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜苷等。本研究通過(guò)薄層色譜法定性鑒別制劑中的人參、當(dāng)歸、川芎3 種成分；根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015 年版一部）化橘紅項(xiàng)下含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法測(cè)定化橘紅中柚皮苷的含量，以柚皮苷作為指標(biāo)性成分控制參茸鹿胎膏的內(nèi)在質(zhì)量，建立參茸鹿胎膏質(zhì)量控制方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

參茸鹿胎膏、人參、當(dāng)歸、川芎（吉林省天強(qiáng)制藥有限公司）；參茸鹿胎膏-2、參茸鹿胎膏-3、參茸鹿胎膏-4（委托吉林省天強(qiáng)制藥有限公司制備，除分別不含有人參、鹿茸和化橘紅外，其他原料和生產(chǎn)工藝與參茸鹿胎膏完全相同）；硅藻土（靈壽縣匯資礦產(chǎn)品有限公司）；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)品、烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；硅膠G（青島海洋化工廠）；三氯甲烷、甲醇、正丁醇、氨水試液、石油醚（分析純）；水為純化水。

1.2 儀器

Agilent 1200series 高效相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Shimadzmn UV-2450 紫外分光光度計(jì)、FA1104 天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9140MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；D ZF-6050 真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；

2 方法與結(jié)果

2.1 人參成分的鑒定

2.1.1 參茸鹿胎膏供試溶液的制備 取參茸鹿胎膏樣品10 g，切碎置于錐形瓶中，加入10 g 硅藻土，混勻、研磨，加入100 mL 甲醇，加熱回流過(guò)濾30 min，將濾液蒸發(fā)干燥，加入30 mL 水溶解殘?jiān)?，倒入分液漏斗中，?0 mL 三氯甲烷對(duì)殘?jiān)M(jìn)行振搖提取，放置待分層后棄去三氯甲烷溶液，保留水溶液層，用20 mL水飽和的正丁醇提取水溶液3 次，合并提取液，40 mL氨水試液洗滌，除去氨水層，將正丁醇層蒸干，藥物殘?jiān)? mL 甲醇溶解作為供試品溶液。

2.1.2 人參陽(yáng)性供試夜的制備 取人參0.5g，加入40mL三氯甲烷，加熱回流1 h，棄去三氯甲烷液，將藥渣中的溶劑揮發(fā)干凈，然后于殘?jiān)屑尤?.5 mL水進(jìn)行攪拌加濕，再于殘?jiān)屑尤?0 mL 水飽和正丁醇溶液，將溶液進(jìn)行超聲處理約30 min，吸取超聲處理后的上清溶液，加入3 倍量氨試液，將其振搖均勻，然后將其放置，待分層后，取出上層液并蒸發(fā)至干，再于殘?jiān)屑尤? mL 甲醇溶液，用甲醇溶液將殘留物進(jìn)行溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)液的制備 取人參皂苷Rg1對(duì)照品，于對(duì)照品中加入一定量的甲醇溶液，將其制備成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照液的制備 取參茸鹿胎膏-2 樣品10g，并按照“2.1.1”項(xiàng)下相同的方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 薄層色譜分析 根據(jù)薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，在同一硅膠G 薄層板上點(diǎn)樣，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）放置在 10 ℃以下的下層溶液作為展開劑[1]展開，用10%硫酸乙醇溶液進(jìn)行噴霧，并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相對(duì)同的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，可以定性鑒別為該處方中的人參，結(jié)果見圖1。

圖1 人參薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatogram of P.ginseng

2.2 當(dāng)歸和川芎成分的鑒別

2.2.1 參茸鹿胎膏供試溶液的制備 取參茸鹿胎膏樣品10 g，切碎置于錐形瓶中，加入30 mL乙醚浸泡至過(guò)夜，將浸泡完全的樣品進(jìn)行超聲處理約10 min，超聲處理后將其過(guò)濾，將濾液進(jìn)行濃縮，直至濃縮約2 mL，將其作為供試品溶液。

2.2.2 當(dāng)歸、川芎陽(yáng)性供試液的制備 另外取1 g 當(dāng)歸對(duì)照藥材以及1g川芎對(duì)照藥材，加入20mL乙醚浸泡，采用“2.2.1”項(xiàng)下同樣的方法制備出對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照液的制備 取參茸鹿胎膏-3 樣品10g，并按照“2.2.1”項(xiàng)下相同的方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 薄層色譜分析 根據(jù)薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 年版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)中提到的方法，吸取上述4 種溶液各2L，置于同一硅膠G薄層板，以展開劑：正己烷-乙酸乙酯（9∶1）展開，在紫外光燈（365 nm）下檢視[2-3]。在供試品的色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，可以用于定性鑒別該處方中的當(dāng)歸和川芎，結(jié)果見圖2。

2.3 柚皮苷含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液制備 取參茸鹿胎膏樣品5 塊，切碎后混合均勻，精密稱量置于錐形瓶中，浸泡過(guò)夜后，超聲處理約40 min，取出并稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足失掉的重量，搖勻同時(shí)濾過(guò)，取濾液，即制備成供試品溶液。

2.3.2 陽(yáng)性對(duì)照品溶液制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成每1 mL 含70μg 的溶液，振搖均勻即制備成了對(duì)照品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 取參茸鹿胎膏-4，并按照“2.3.1”項(xiàng)下相同的方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 色譜分析與含量測(cè)定 色譜柱：AgilentC18（4.6mm 200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸（31∶69）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

圖2 當(dāng)歸和川芎薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatogram of A.sinensis and L.chuanxiong

精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，在對(duì)照品色譜圖出峰的保留時(shí)間位置上，供試品溶液色譜圖也出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，且陰性對(duì)照品色譜圖無(wú)干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 柚皮苷對(duì)照品溶液（A）、樣品溶液（B）及陰性樣品溶液（C）色譜圖Fig.3 Chromatograph of naringin reference solution(A),sample solution(B)and negative sample solution(C)

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取適量的柚皮苷對(duì)照品，加入甲醇制成0.076 7 mg/mL 的溶液，分別精密吸取 1、2、3、4、5 μL 測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為y= 3.343+2 009.66x（r=0.999 9）。結(jié)果表明，柚皮苷在0.1～0.4 mg 呈線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取5μL對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，重復(fù)6 次，測(cè)定色譜峰面積值，得出RSD 為0.3%，表明該方法精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行6 次獨(dú)立測(cè)定，測(cè)得RSD 為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次樣品，根據(jù)“2.3.5”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、6、12 和 24 h 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰面積積分值變化的RSD 為1.2%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液中柚皮苷的含量基本穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品6 份，每份0.50 g 左右，分別精密加入20 mL 對(duì)照品溶液（0.009 13 mg/mL，50%乙醇配制），按照“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率（表1），該方法回收率較好、準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率試驗(yàn)Table 1 Recovery rate test

2.3.10 樣品含量測(cè)定 按照“2.3.1”項(xiàng)下方法及“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定3 批樣品（171001、171002、171003）所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 批樣品的平均含量分別為1.81、1.82、1.83 mg/丸，該樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015 年版一部）化橘紅的含量測(cè)定限度和該處方中化橘紅的量，暫定本品每丸含化橘紅以柚皮苷（C27H32O14）計(jì)，不得少于 1.6 mg。

2.4 烏頭堿限量檢查

2.4.1 參茸鹿胎膏供試樣品的制備 取參茸鹿胎膏樣品17 g，切碎置于錐形瓶中，于具塞錐形瓶中加入150 mL 乙醚，將兩者進(jìn)行振搖約10 min，然后加入10 mL氨試液，繼續(xù)振搖30 min，放置1～2 h，分離醚層，蒸發(fā)至干，于殘?jiān)屑尤? mL 的無(wú)水乙醇，并使之溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 烏頭堿陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品，加入一定量的無(wú)水乙醇，制成1mg/mL 的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4.3 薄層色譜分析 根據(jù)薄層色譜法（中國(guó)藥典2015 年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，取12μL 供試品溶液、5 μL 對(duì)照品溶液，分別置于同一硅膠G 薄層板上，以展開劑：甲苯-乙酸乙酯-二乙胺(14∶4∶1)展開[4]，用稀碘化鉍鉀試液噴霧。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖4。

圖4 烏頭堿限量薄層色譜圖Fig.4 Thin layer chromatogram of aconitine limit

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定參茸鹿胎膏中柚皮苷的含量，在研究流動(dòng)相的選擇過(guò)程中，對(duì)多種流動(dòng)相以及流速進(jìn)行了考察，曾試用乙腈 0.088%甲酸水溶液（23.3∶76.7）、甲醇 0.2%冰醋酸、甲醇-醋酸-水（30∶4∶70）作為流動(dòng)相[5-7]，但制劑中柚皮苷色譜峰分度較差，最終采用甲醇 0.1%冰醋酸（31∶69）作為本試驗(yàn)流動(dòng)相，通過(guò)對(duì)色譜條件的考察及方法學(xué)的考察證明，該操作可行，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好，可以作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

綜上所述，本試驗(yàn)分別通過(guò)薄層色譜鑒別法、限量檢查以及高效液相色譜法對(duì)參茸鹿胎膏進(jìn)行定性鑒別和定量分析，為參茸鹿胎膏的質(zhì)量控制提供了一定參考。