6種葉面肥對人參皂苷和農藥殘留含量的影響

金春愛，王玉方，劉政波，孫海，張春閣，肖家美，張亞玉,2※

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112；2.成都大學藥學與生物工程學院，成都 610106）

人參（Panax ginseng C.A.Mey）系五加科人參屬多年生草本植物，在中國已有數(shù)千年的藥用歷史。《神農本草經》中記載：“人參，味甘、微苦，微溫，主補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心、益智、久服輕身延年”[1]?，F(xiàn)代藥學研究證明，人參中主要有效成分是人參皂苷。目前，在人參中已經確定結構的人參皂苷有 40 多種，其中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等 6種單體皂苷的質量分數(shù)占總皂苷的90%以上[2]。人參生長發(fā)育周期長，隨著年限的增長，參株需肥、吸肥強度也逐年增加。蟲害和病害是影響人參植株健康生長的主要外在因素[3]。在人參生長旺盛期，根外噴施葉面肥，對于保證養(yǎng)分的供應，促進人參生長，減少病蟲害發(fā)生具有重要作用。

曹秀英等[4]研究發(fā)現(xiàn)，5、6年生人參上噴施復合葉面肥，總皂苷含量可提高8.3%。陳少麟等[5]研究發(fā)現(xiàn)，土帝樂葉面肥在人參上應用，增產效果顯著，以400 倍液最佳，對生長勢的增幅均有提高。莖高、莖粗、葉面積分別比對照高出9.89%、15.28%、21.42%。李世榮等[6]研究發(fā)現(xiàn)，噴施追施寶后能夠加快人參植株的生長速度，植株矮壯、葉片變大、葉色濃綠、有光澤，使得人參光合作用能力增強，干物質積累增加，促進了人參生長發(fā)育，進而提高了單支重和單位面積產量。劉政波[7]研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸、海藻素、天達2116 藥材專用、志信高鎂、磷酸二氫鉀處理對人參葉綠素、根粗、株高、根長、根干鮮、元素吸收均有顯著影響。

本實驗以2 年生人參為試驗材料，以噴清水為對照組（CK），進行葉面肥噴施處理，當年采收的人參根利用超高效液相色譜法和氣相色譜法分別測定12 種單體皂苷和5 種有機氯農藥殘留，旨在研究葉面肥噴施對人參皂苷和農藥殘留含量的影響。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 試驗地點及土壤狀況 試驗地點為黑龍江省海林市福海參業(yè)有限公司參場，北緯44°34′、東經128°91′，海拔256 m，參棚為遮陰防雨棚。實驗地土壤因子分別為有機質含量138.04 g/kg、速效鉀含量171.15 mg/kg、堿解氮含量24.14 mg/kg、pH值5.22；地力均勻一致。

1.1.2 肥料用量與處理組 實驗用6 種葉面肥名稱及稀釋比例見表1。

1.1.3 試驗設計、樣品采集與制備 試驗田間采用隨機區(qū)組排列，設6 個處理組和1 個空白對照組，每個處理設3 個重復。試驗選擇人工栽培2 年生人參，行距15 cm，株距 3～5 cm，密度 200 株/m2左右。7 月 3 日開始噴葉面肥，之后每7 天噴施1 次，共噴3 次。噴施量均以葉面正面濕潤為宜，處理區(qū)域不進行土壤施肥處理。9 月7 日采樣。每小區(qū)隨機取20 株參苗洗凈根部，陰干24 h，40℃烘箱內干燥，研磨成粉末，過60 目篩，備用。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；6890N 氣相色譜儀（美國安捷倫公司）。

單體皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1（S）、Rg2（S）、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3（S）、Rh2（S）（中國藥品生物制品檢定所）；六六六（– BHC、– BHC– BHC、–BHC）、五氯硝基苯（1000g/mL，農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

表1 肥料用量與處理組Table1 The and Number of fertility

2 方法

2.1 單體皂苷測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 50 mm，1.7m）；流動相：乙腈 0.000 5%磷酸水溶液（梯度洗脫：0～3 min，17%～19%乙腈；3.0～4.0 min，19%～21%乙腈；4.0～4.5 min，21%～24%乙腈；4.5～5.0min，24%～28%乙腈；5.0～6.5 min，28%乙腈；6.5～7.5 min，28%～30%乙腈；7.5～9.5 min，30%～36%乙腈；9.5～11.0min，36%～40%乙腈）；柱溫：35℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：2L。

2.1.2 混合標準品溶液的制備 分別精密稱取12 種單體人參皂苷10mg 于100 mL 容量瓶中，加甲醇配置成0.1 mg/mL 混合溶液，將混合對照品溶液分別用甲醇稀釋 100 倍、5 倍、2.5 倍、1.25 倍、1 倍，制成一系列濃度的混合標準品溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 精確稱取1 g 樣品（精確到0.000 1 g），用定量濾紙包好，放到索氏提取器中，加50 mL 氯仿，80℃回流1 h，然后把紙包烘干。把樣品加到50 mL 三角瓶中，加50 mL 水飽和正丁醇浸泡過夜，超聲波振蕩1 h，全部過濾。濾液全部放到蒸發(fā)皿中，沸水浴蒸干，1.0 mL 超純水溶解，用色譜純甲醇反復洗蒸發(fā)皿，加到10 mL容量瓶中并定容，搖勻，并過0.22m有機濾膜，用高效液相色譜儀測定12 種單體人參皂苷含量。

2.1.4 線性關系與定量限 按“2.1.1”項下條件，將皂苷混合標準液按濃度從小到大依次進樣，以峰面積為因變量、濃度為自變量計算回歸方程。12 種單體人參皂苷在0.001～0.1 mg/mL 范圍內線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均在0.999 以上。當信噪比為10 時，測得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rh1（S）、Rg2（S）、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3（S）、Rh2（S）的定量限分別為 0.68、0.72、0.76、0.40、0.35、0.92、0.78、0.81、0.57、0.25、0.20、0.36%。本實驗中低于定量限的結果不報。

2.2 有機氯農藥殘留測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：DB-1701（30 m 0.25 mm 0.25μm）；載氣：高純氮氣（純度為99.999%以上）；進樣口溫度：220℃；ECD 檢測器：300 ℃，氫氣 35 mL/min，空氣300 mL/min；柱溫：初始溫度為70 ℃，保持0.5 min后，以 10 ℃/min 速率升溫到 240 ℃，保持 6 min；載氣流速：1.0 mL/min；進樣量：1L。

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密吸取1.0 mL 六六六（-BHC、-BHC-BHC、-BHC）、五氯硝基苯對照品，置于10 mL 容量瓶中，加正己烷稀釋并混勻，即得100g/mL混合標品。用正己烷逐步稀釋成0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001g/mL 的系列標準溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 精確稱取1.5 g（精確到0.000 1g）樣品于50 mL 離心管中，加 10 mL 水靜置過夜，加15 mL 乙腈超聲提取20 min，渦旋振蕩2 min，加5 g氯化鈉超聲并渦旋混勻，3 500 r/min 離心5 min，取上清液轉移至裝有1 g 無水硫酸鈉的50 mL 離心管中。殘渣重復提取2 次，合并上清液振搖放置1 h，離心，上清液過濾至多樣品平行蒸發(fā)儀的樣品瓶中，洗離心管和濾紙并入上述樣品瓶中，減壓回收溶劑近干，氮氣吹干，用5 mL 石油醚溶解樣品轉移至10 mL 玻璃離心管中，加0.5mL 濃硫酸凈化，離心，上清液轉移至另一試管中，用少量石油醚反復洗滌試管離心后合并凈化液，氮氣吹干，準確加入1.0 mL 石油醚混勻，過0.22m 有機相濾膜，用氣相色譜法測定六六六（包括4 種異構體）、五氯硝基苯含量。

2.2.4 線性關系與定量限 按“2.2.1”項下條件，將混合標準液按濃度從小到大依次進樣，以峰面積為因變量、濃度為自變量計算回歸方程。結果，5 種農藥組分在0.008～0.2g/mL 濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均在0.999 以上。當信噪比為10 時，測得農藥殘留各組分定量限為2.67 10-4mg/kg。本實驗中低于定量限的結果不報。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理采用SAS統(tǒng)計軟件進行分析，差異水平P ＜ 0.05。

3 結果與分析

3.1 不同葉面肥對單體人參皂苷的影響

12 種單體人參皂苷對照品和樣品溶液在203 nm處色譜圖分別見圖1（a）和圖1（b）。各試驗組均未測出 Rg3（S）、Rh2（S）；FF-1 號葉面肥處理中人參 Re 含量提高了3.27%；FF-3 號葉面肥處理中人參Re、Rc、Rb2、Rb3 含量有明顯的提高作用，分別提高3.27%、11.36%、24.38%、23.81%；FF-6 號葉面肥處理中人參Rc、Rb2 含量有明顯的提高，分別提高5.11%、8.75%；FF-4 號葉面肥處理中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等 6種皂苷均低于對照組，分別降低了38.81%、9.81%、20.29%、15.91%、10.62%、33.49%。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

表2 人參皂苷含量及折干率Table 2 The content of ginsenosides and drying rate （%）

3.2 不同葉面肥對人參中有機氯農藥殘留含量的影響。

由表3 可知，除FF-1 處理組外，其它5 組葉面肥處理組的五氯硝基苯含量較對照組均有下降，分別下降11.9%、29.7%、37.7%、25.4%、23.0%；FF-3、FF-4、FF-5、FF-6 組的-六六六含量較對照組均有下降，分別下降13.25%、20.19%、18.90%、53.31%。

表3 葉面肥對有機氯農藥殘留含量的影響Table 3 Effect of foliage fertilizer on the organochlorine residue

人參農藥殘留測定的標準品色譜圖和樣品色譜圖見圖2（a）和圖2（b）。

圖2 農藥殘留氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of pesticide residue

4 討論

本實驗的所有樣品中均未檢測出人參皂苷 Rf、Rh1（S）、Rg2（S）、Rb1、Rb3、Rg3（S）和 Rh2（S），是因為樣品中該種人參皂苷含量過低，低于定量限或不含，所以未檢測到。FF-3 處理組中 Re、Rb1、Rc、Rb2 等單體皂苷含量均有顯著提高，分別提高3.271%、0.362%、11.364%、24.375%；FF-6 處理組中Rc、Rb2 含量均有提高，分別提高5.114%、8.750%。這與Zhang H[8]的葉面噴施微肥有效促進人參皂苷的積累的實驗結果一致。

宋欣瑤[3]研究表明，以拌土方式施藥時，五氯硝基苯在參地土壤、人參根、莖葉間的遷移規(guī)律為五氯硝基苯由土壤向人參根中遷移，由人參根向人參莖葉中遷移。本實驗中天達2116 藥材專用（FF-3）、志信高鎂（FF-4）、磷酸二氫鉀（FF-5）、海藻（FF-6）等葉面肥處理組均表現(xiàn)五氯硝基苯和-BHC 含量降低，這與陳勇[9]利用葉面肥降低農藥殘留結果相符。

不同葉面肥對人參皂苷的積累效果不同。實驗結果表明，天達2116 藥材專用葉面肥（FF-3）對人參皂苷積累效果最佳，其次為海藻葉面肥（FF-6）；FF-3、FF-4、FF-5、FF-6 均表現(xiàn)出降低農藥殘留的能力，其中，志信高鎂（FF-4）最優(yōu)，其次為天達 2116 藥材專用（FF-3），磷酸二氫鉀（FF-5），海藻（FF-6）。綜合以上兩個方面，本研究中天達2116 藥材專用（FF-3）具有較好的提升皂苷含量與降低農藥殘留含量的效果。