補腎抗風(fēng)濕方藥對CIA大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的影響

龐學(xué)豐　蒙宇華　馮玉青　吳燕紅　唐麗萍　劉歡　龍朝陽　廖鍵僥　舒建龍　李玉玲　雷宗尚　林菊

【摘 要】目的：觀察補腎抗風(fēng)濕方藥寒痹康湯對CIA大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的影響，揭示其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨質(zhì)侵蝕的作用機制。方法：采用弗氏不完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)CIA大鼠模型，將60只Wistar大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，甲氨蝶呤組，寒痹康湯高、中、低劑量組，以甲氨蝶呤組為對照，觀察不同劑量寒痹康湯對CIA大鼠骨組織RANKL、RANK和OPG表達(dá)水平的影響。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織的RANKL mRNA、RANK mRNA、RANKL蛋白、RANK蛋白的表達(dá)升高，OPG mRNA、OPG蛋白的表達(dá)下降（P < 0.01）；與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和甲氨蝶呤組的RANKL mRNA、RANK mRNA、RANKL蛋白、RANK蛋白的表達(dá)均有不同程度的下降，OPG mRNA、OPG蛋白的表達(dá)均有不同程度的升高（P < 0.01或P < 0.05），其中以寒痹康湯高劑量組最明顯；寒痹康湯高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：寒痹康湯能抑制CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重度，提高骨組織中OPG蛋白和基因表達(dá)，抑制RANKL和RANK的蛋白和基因表達(dá)，提示其具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨質(zhì)侵蝕的作用，機制可能與調(diào)控OPG/RANKL/RANK破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；補腎抗風(fēng)濕方藥；寒痹康湯；RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)；CIA大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.002

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of invigorating kidney and anti rheumatism prescription Hanbi Kang Tang（寒痹康湯） on the RANKL/RANK/OPG bone tissue system of CIA rats to reveal its mechanism of anti- Rheumatoid Arthritis bone erosion.Methods：Bovine type II collagen emulsified with Freunds incomplete adjuvant was used to induce CIA rat models.Sixty Wistar rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，a methotrexate group，and Hanbi Kang high，medium and low dose groups.The methotrexate group was used as an object of reference to observe the influence of difference doses of Hanbi Kang Tang on the expression of rat bone tissue RANKL，RANK and OPG.Results：Compared with the normal control group，the expressions of RANKL mRNA，RANK mRNA，RANKL，and RANK proteins in rats of the model control group increased，while the expressions of OPG mRNA and OPG proteins decreased（P < 0.01）.Compared with the model group，the expressions of RANKL mRNA，RANK mRNA，RANKL，and RANK proteins in rats of the Hanbi Kang groups and the methotrexate group decreased in different degree，while the expression of OPG mRNA and OPG proteins decreased

（P < 0.01 or P < 0.05），among which the Hanbi Kang high dose group was the most obvious，with no significant difference compared with the methotrexate group（P > 0.05）.Hanbi Kang could inhibit the progression of arthritis in CIA rats，improving the expressions of OPG protein and gene in bone tissue，and inhibiting the expressions of RANKL and RANK proteins and gene.Conclusion：Hanbi Kang Tang has the effect of anti-RA bone erosion，whose mechanism may be related to the regulation of OPG/RANKL/RANK osteoclast differentiation regulating signal transduction system.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；prescription of invigorating kidney and anti rheumatism；Hanbi Kang Tang（寒痹康湯）；RANKL/RANK/OPG system；CIA rat

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種機體對自身滑膜發(fā)生免疫反應(yīng)為主要表現(xiàn)的疾病，而骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是RA常見的臨床合并癥。OPG/RANKL/RANK是一組新近發(fā)現(xiàn)的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號因子，在RA的骨質(zhì)侵蝕中扮演重要角色，可能成為RA治療的新靶點。本實驗采用牛Ⅱ型膠原蛋白和弗氏不完全佐劑混合誘導(dǎo)CIA大鼠模型，觀察寒痹康湯對CIA大鼠骨組織RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的影響，探討其治療RA骨質(zhì)侵蝕的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只健康級Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量（100±10） g，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗試劑及藥品 弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白（美國Chondrex公司）；甲氨蝶呤[MTX，上海醫(yī)藥（集團）有限公司信誼制藥總廠]；補腎抗風(fēng)濕方藥（寒痹康湯）提取物（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院新藥研發(fā)中心制備），將寒痹康湯（秦艽15 g、黃芪15 g、青風(fēng)藤15 g、防風(fēng)10 g、熟附子10 g、麻黃10 g、當(dāng)歸10 g、淫羊藿20 g、狗脊20 g）經(jīng)乙醇萃取，50 ℃溶解離心，取上清液得到含有活性部位的浸膏，實驗前用溶劑（2%乙醇+ 98%的生理鹽水）配制成2×10-7 g·L-1的溶液。

2 方 法

2.1 造模方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機取10只為正常對照組，其余大鼠參照文獻(xiàn)[1]方法進行造模：在無菌條件下，用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，濃度為4 mg·L-1，置4 ℃冰箱過夜后，再與等體積弗氏不完全佐劑

（1 mg·mL-1）混合、震蕩充分乳化，制成C II乳劑，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗時于每只大鼠頸、背部多點皮內(nèi)注射0.25 mL致炎，于14 d后按上述方法和劑量再次注射免疫。造模成功（大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹、踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度≥2 mm，評分在4分以上）后隨機分為5組：模型對照組，MTX組，寒痹康湯高、中、低劑量組，每組10只。全部大鼠造模均成功，實驗過程中無死亡。

2.2 給藥方法 造模成功再次分組后，開始給藥（劑量參照文獻(xiàn)[1]）：正常對照組大鼠自由進食和飲水；模型對照組予生理鹽水2 mL·（100 g）-1

灌胃，每日1次；MTX組灌服MTX藥液2.7 mg·kg-1

（為70 kg成人臨床用藥3倍），每只約0.405 mg，

每周1次；寒痹康湯高、中、低劑量組，分別以31.25，15，7.5 g·（100 g）-1灌胃，每日2次。

2.3 取材方法 正常對照組及各實驗組大鼠治療36 d后處死，以無菌器械迅速取下右側(cè)脛、股骨，剝離肌肉和軟組織，骨組織稱重后裝入DEPC處理過的1.5 mL離心管，投入液氮。全部動物取材完畢后轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存。

2.4 Western blot檢測 骨組織中提取總蛋白，每個標(biāo)本取80 μg蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白含量，每個孔上樣量為30 μg，加上樣緩沖液，PCR儀99.9 ℃變性5 min，4 ℃?zhèn)溆?。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%濃縮膠，上樣電泳，進行SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，100 mA轉(zhuǎn)膜1 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST、TBS 洗膜后一抗RANKL（1∶200稀釋）、RANK（1∶200稀釋）、OPG（1∶1000 稀釋）、Actin（1∶200稀釋）

4 ℃過夜。次日，TBST、TBS洗膜后二抗室溫孵育1 h，經(jīng)過ECL化學(xué)發(fā)光，采集圖像光密度，獲得圖像用Image Tool 3.0測定并分析條帶吸光度（IA），以Actin為內(nèi)參。

2.5 實時定量PCR檢測 用Trizol試劑（美國Gibco公司）提取骨骼肌組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR擴增。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。引物由上?；鶢栴D生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：OPG正義鏈5'-TCCTGGCACCTACCTAATACAGCA-3'，

反義鏈5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'；

RANK正義鏈5'-ACGTGGACCCTTGCCCCAGT-3'，

反義鏈5'-ACTGGCCACCAGGGGAGCTT-3'；RANKL

正義鏈5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'，反義

鏈5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'。管家基因Actin作為內(nèi)參，正義鏈5'-CGGGAAATCGTGCG

TGACAT-3'，反義鏈5'-GAACTTTGGGGGATGCTCG

-3'。PCR反應(yīng)體系：5×PCR緩沖液10 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，GAPDH上、下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq酶1 μL，雙蒸水32 μL，

cDNA 模板5 μL。PCR反應(yīng)條件：50 ℃2 min，

95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃45 s，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。按照ΔΔCt解析法進行目的基因與管家基因的相對定量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用方差分析及χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 寒痹康湯對CIA大鼠骨組織RANKL表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織的RANKL mRNA的表達(dá)升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組的RANKL mRNA的表達(dá)均不同程度的下降

（P < 0.01或P < 0.05），其中寒痹康高劑量組下降最明顯；但與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（P > 0.05）。見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織RANKL 蛋白的表達(dá)升高

（P < 0.01）；與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組RANKL蛋白的表達(dá)均不同程度的下降（P < 0.01 或P < 0.05），其中寒痹康高劑量組下降最明顯，寒痹康高劑量組與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。上述結(jié)果提示，寒痹康湯能下調(diào)CIA大鼠骨組織中的RANKL表達(dá)，其改善CIA大鼠骨質(zhì)疏松的作用可能與下調(diào)骨骼肌RANKL的表達(dá)有關(guān)。

3.2 寒痹康湯對CIA大鼠骨組織RANK表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織RANK mRNA的表達(dá)升高（P < 0.01）；與對模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組RANK mRNA的表達(dá)均不同程度的下降（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康湯高劑量組下降最明顯；但寒痹湯高劑量組與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織RANK蛋白的表達(dá)升高（P < 0.01）；

與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組RANK蛋白的表達(dá)均不同程度的下降（P < 0.01 或P < 0.05），寒痹康湯高劑量組下降最明顯；但寒痹康湯中劑量組、寒痹康湯高劑量組與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。上述結(jié)果提示，寒痹康湯能下調(diào)CIA大鼠骨組織中RANK的表達(dá)，其改善CIA大鼠骨質(zhì)疏松的作用可能與下調(diào)骨骼肌RANK的表達(dá)有關(guān)。

3.3 寒痹康湯對CIA大鼠骨組織OPG表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織OPG mRNA的表達(dá)下降（P < 0.01）；與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組OPG mRNA的表達(dá)均不同程度的升高（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康湯高劑量組升高最明顯；但寒痹康湯高劑量組與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（P > 0.05）。見表3。與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨組織的OPG蛋白的表達(dá)下降（P < 0.01）；

與模型對照組比較，寒痹康湯各劑量組和MTX組的OPG蛋白的表達(dá)均不同程度的增加（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康湯高劑量組增加最明顯；但寒痹康湯高劑量組與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見圖3。上述結(jié)果提示，寒痹康湯能上調(diào)CIA大鼠骨組織中OPG的表達(dá)，其改善CIA大鼠骨質(zhì)疏松的作用可能與上調(diào)骨骼肌OPG的表達(dá)有關(guān)。

4 討 論

RA的基本病理特征是炎癥性滑膜炎伴關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，破骨細(xì)胞及其功能增強是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要原因。研究表明，破骨細(xì)胞的大量形成和激活尚與RA關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞密切相關(guān)[3]，RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是與破骨細(xì)胞分化及活化過程密切相關(guān)的細(xì)胞因子，包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）和護骨素（osteoprotegerin，OPG）。RANKL的主要生物活性為促進破骨細(xì)胞及前體細(xì)胞的分化、成熟和活化，阻止破骨細(xì)胞凋亡[4]。其活性的高低決定破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞程度，是炎性關(guān)節(jié)疾病骨質(zhì)破壞過程中最重要的因素[5]。OPG抑制骨吸收是其最顯著的作用。OPG競爭性與RANKL結(jié)合，封閉RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，OPG/RANKL比值是破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)的決定性因素。

RANKL和OPG是RA發(fā)病過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在RA中，活化的T淋巴細(xì)胞通過RANKL介導(dǎo)滑膜巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，引起骨丟失。在實驗動物模型中，炎癥部位多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)成骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANK，其與RANKL結(jié)合后，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）或活化c-Jun氨基末端激酶，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞[6]。有文獻(xiàn)報道，在佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型中，炎癥活動部位可檢測到RANKL的表達(dá)且與增加破骨細(xì)胞生成活化相一致，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨與關(guān)節(jié)破壞，給予OPG可抑制骨關(guān)節(jié)的破壞[7]。Coetzee等[8]認(rèn)為，骨髓微環(huán)境中OPG/RANKL比值可能決定了活化破骨細(xì)胞的活性，從而影響骨吸收率及骨密度。OPG可阻止RANKL引起的骨質(zhì)疏松，但不抑制炎癥反應(yīng)而減輕關(guān)節(jié)腫脹。OP在RA患者中普遍存在，而且是RA患者骨和關(guān)節(jié)侵犯的一種早期表現(xiàn)。Pettit等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者骨關(guān)節(jié)中RANKL的表達(dá)相對OPG更局限，大多分布于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞處，即關(guān)節(jié)面血管翳與骨的交界處。由此可見，破骨細(xì)胞及調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的OPG/RANKL系統(tǒng)與骨質(zhì)疏松、RA的骨破壞有著密切的聯(lián)系。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。”《素問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛?！北圆〉陌l(fā)生與正氣虧虛及感受風(fēng)寒濕之邪有關(guān)，其治療當(dāng)以扶正祛邪為原則。寒痹康湯是筆者治療寒濕型活動期RA的經(jīng)驗方，由補腎及抗風(fēng)濕藥物組成，具有補益肝腎、益氣血、祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛的作用。筆者在臨床上運用寒痹康湯治療寒濕型RA患者，發(fā)現(xiàn)其能改善患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、壓痛、晨僵等癥狀，能使升高的紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子、免疫球蛋白等下降或恢復(fù)正常，無明顯毒副作用[10]。臨床研究還表明，寒痹康湯能降低RA繼發(fā)骨質(zhì)疏松患者的骨源性堿性磷酸酶水平，提高血鈣及骨密度，可明顯改善臨床癥狀、骨質(zhì)疏松及骨代謝狀況[11]。動物實驗表明，寒痹康湯能降低CIA大鼠腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、NF-κB、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的水平[12-14]。而這些細(xì)胞因子在RA的發(fā)病、發(fā)展過程當(dāng)中起到非常重要的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)寒痹康湯治療后，CIA大鼠骨組織RANKL mRNA、RANK mRNA表達(dá)水平均相應(yīng)降低，OPG mRNA表達(dá)水平升高，表明寒痹康湯可以通過影響RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，從而達(dá)到治療RA及骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的目的，是其治療RA的作用機制之一。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 鄧安梅，仲人前，陳孫孝，等.關(guān)節(jié)炎中B7：CD28/CTLA-4共刺激途徑的實驗研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2000，16（8）：412-414.

[2] 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實驗方法學(xué)[M].

3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1861.

[3] Abu-Amer Y，Abbas S，Hirayama T.TNF receptor type I regulates RANK ligand espression by stromal cells and modulates osteoclastogenesis[J].J Cell Biochem，2004，93（5）：980-989.

[4] Saidenberg-Kermanac'h N，Conado A，Lemeiter D.

TNF-α antibodies and osteoprotegerin decrease systemic bone loss associated with inflammation through distinct mechanisms in collagen-induced arthritis[J].Bone，2004，35（5）：1200-1207.

[5] Page G，Miossec P.RANK and RANKL expression as markers of dendritic cell-T cel1 interactions in paired samples of rheumatoid synovium and lymph nodes[J].Arthritis Rheum，2005，52（8）：2307-2312.

[6] Jones DH，Kong YY，Penninger JM.Role of RANKL and RANK in bone loss and arthritis[J].Ann Rheum Dis，2002，61 Suppl2：32-39.

[7] Romas E，Gillespie MT，Martin TJ.Involvement of receptoractivator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-α in bone destruction in rheumatoid arthritis[J].Bone，2002，30（2）：340-346.

[8] Coetzee M，Kruger MC.Osteoprotegerin-receptor

activator of nuclear factor-kappaB ligand ratio：a new approach to osteoporosis treatment？[J].South Med J，2004，97（5）：506-511.

[9] Pettit AR，Walsh NC，Manning C，et al.RANKL protein isexpressed at the pannus-bone interface at sites of articular bone erosion in rheumatoid arthritis[J].Rheumatology（Oxford），2006，45（9）：1068-1076.

[10] 龐學(xué)豐，吳燕紅，蒙宇華.補益肝腎、祛濕蠲痹法治療寒濕型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14（1）：40-42.

[11] 龐學(xué)豐，劉歡，吳燕紅，等.補腎抗風(fēng)濕中藥聯(lián)合西藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)骨質(zhì)疏松臨床研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（1）：47-49.

[12] 龐學(xué)豐，任志宏，程世和，等.寒痹康湯對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響[J].陜西中醫(yī)，2009，30（7）：919-920.

[13] 龐學(xué)豐，王乾，吳燕紅，等.寒痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（7）：32-34.

[14] 龐學(xué)豐，舒建龍，李玉玲，等.寒痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清VEGF的影響[J].陜西中醫(yī)，2015，36（5）：616-618.

收稿日期：2015-09-14；修回日期：2015-10-28