JunD在浸潤性乳腺癌分子亞型中的表達及意義

代新珍，米賢軍，鐘守軍，段立鋒，楊偉洪，劉祥玉，徐秀梅，黃兆華

（中山市博愛醫(yī)院病理科，廣東中山 528403）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有上升并有年輕化的趨勢，占女性腫瘤死亡原因的第二位。目前研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個極為復雜的過程，其中癌基因的活化、抑癌基因缺乏起主導作用。近年來隨著對AP-1 家族成員研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的形成、侵襲和轉移等生物學過程，而JunD 作為AP-1 家族成員中重要的一員，很多研究預測并提示JunD基因參與腫瘤的增殖、分化與凋亡，并在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中充當重要角色［1-2］。然而目前國內外對于JunD 在乳腺癌組織中的表達及具體作用的研究鮮有報道。本研究應用免疫組織化學方法（SP 法）檢測JunD 在浸潤性乳腺癌分子亞型及乳腺良性惡性病變中的表達情況，分析其差異表達與臨床的相關性，期望為浸潤性乳腺癌分子亞型的臨床治療及乳腺良惡性病變的鑒別診斷提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

隨機抽取2013 年7 月至2019 年7 月經(jīng)手術切除且經(jīng)我科3 位病理醫(yī)生證實的乳腺增生性病變191 例（乳腺腺病48 例，纖維腺瘤40 例，普通型導管增生30 例，乳頭狀瘤20 例，乳腺不典型增生20 例，導管原位癌33 例），20 例正常乳腺組織作為對照，乳腺浸潤性導管癌160 例。其中乳腺浸潤性導管癌患者中位年齡49（28～80）歲；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ期分別有52、108 例；組織學分級Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ級分別有17、143 例；有淋巴結轉移62 例，無淋巴結轉移98 例；乳腺癌患者中術后標本腫物直徑≤2 cm 的78 例，腫物直徑＞2 cm 的82 例。依據(jù)2013 St Gallen 國際乳腺癌會議分子亞型標準共識［3］，乳腺癌分為Luminal A 型22 例，Luminal B 型（Her2-）23 例，Luminal B 型（Her2+）69 例，Her2 受體陽性型28 例，TNBC 亞型（basallike）18 例。所有乳腺癌患者均是首次住院行腫塊切除術，未做放療、化療及內分泌治療，也未進行腋窩淋巴結活檢手術以及腋窩的其他手術，均行乳腺癌改良根治術或乳腺腫物切除術，術前臨床資料完整。所有患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)本單位倫理委員會審核同意免倫理審批。

1.2 試 劑

兔單克隆抗體JunD 購自abcam 及SP 試劑盒購自羅氏公司。

1.3 免疫組織化學

JunD 抗體工作濃度為1∶300。用PBS 液代替第一抗體作陰性對照。主要步驟：采用免疫組織化學SP 法染色，按說明書操作。以pH 6.0 的拘緣酸鹽緩沖液微波修復抗原，滴加1∶300 JunD 單克隆抗體80 μL，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，試劑盒贈送的陽性片作為陽性對照，4 ℃過夜孵育；PBS 洗后，滴加過氧化酶標記的二抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗后，DBA 顯色；蘇木素復染、脫水、透明、中性樹脂封片。

1.4 陽性結果判斷

ER、PR、HER2 判定根據(jù)《乳腺癌HER2 檢測指南（2014 版）》［4］；ER、PR、Ki67 定位于細胞核，HER2定位于細胞膜。JunD定位于細胞核，判斷方法為在鏡下觀察，根據(jù)棕色反應的陽性強度及面積判斷結果。采用二級積分法：陽性細胞數(shù)≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，≥75%為4分；染色強度淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕黃色為3分；最后計算兩者得分相乘，閱片采用雙盲法讀片。本標本中染色一般為棕黃色，表達差異主要在于表達范圍的不同，結果得分大致分布在0～4 分與9～12 分區(qū)間，故本實驗以兩者得分相乘≥9 分判讀為陽性（即表達范圍大于50%判讀為陽性）。閱片采用雙盲法讀片。

1.5 統(tǒng)計學處理

全部統(tǒng)計分析用SPSS 19.0完成。兩組樣本間為分類資料，理論數(shù)字均大于5，故均采用四格表非校正卡方檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JunD 在乳腺組織中的表達

JunD 在乳腺組織的表達定位于細胞核，染色一般為棕黃色，表達差異主要在于染色范圍的不一致，其在乳腺組織中的代表性染色見（圖1）。160 例浸潤性乳腺癌組織中JunD 陽性表達率為45.6%（73/160），20 例乳腺正常組織中JunD 陽性表達率為100%（20/20），48 例乳腺腺病中JunD 陽性表達率87.5%（42/48），30 例乳腺纖維腺瘤中JunD 陽性表達率90.0%（27/30），30 例乳腺普通型導管增生中JunD 陽性表達率90.0%（27/30），20 例JunD 乳腺導管內乳頭狀瘤中JunD 陽性表達率95.0%（19/20），20 例乳腺導管上皮不典型增生中JunD 陽性表達率90.0%（18/20），33 例乳腺導管原位癌中JunD 陽性表達率87.9%（29/33）。比較不同病理類型中JunD 的表達發(fā)現(xiàn)，JunD 在浸潤性導管癌中的表達水平明顯低于正常乳腺組織及乳腺導管上皮增生性病變中的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），正常乳腺組織與乳腺導管上皮增生性病變中JunD 表達均較高，兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表1）。

圖1 JunD 在不同的乳腺組織中有代表性的染色情況Fig.1 Representative immunohistochemicai staining of JunD in different breast tissues

2.2 JunD 的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

JunD 在乳腺浸潤性導管癌中的陽性表達率為45.6%（73/160），在組織學Ⅰ級與Ⅱ級+Ⅲ級之間（陽性表達率分別是82.4%、41.3%，P=0.001），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在患者年齡≤50 歲與＞50歲之間（陽性表達率分別是47.4%、42.9%，P=0.571），在腫瘤直徑≤2 cm 與＞2 cm 之間（陽性表達率分別是44.9%、46.3%，P=0.852），腫瘤TNM 分期中Ⅰ期與Ⅱ+Ⅲ期之間（陽性表達率分別是46.2%、45.4%，P=0.926），在腋窩淋巴結無轉移與轉移之間（陽性表達率分別是51.6%、46.9%，P=0.564），在ER 陽性與陰性之間（陽性表達率分別是43.9%、50.0%，P=0.480），在PR 陽性與陰性之間（陽性表達率分別是47.4%、42.9%，P=0.571），差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表1）。

2.3 JunD 在Luminal A 型、Luminal B 型、Her2 受體陽性型和TNBC 亞型中的表達

JunD 在各分子亞型中的表達情況見（圖2），結果如下：Luminal A 型陽性表達率為40.9%（9/22），Luminal B 型（Her2-）陽性表達率為30.4%（7/23），Luminal B 型（Her2+）陽性表達率為49.3%（34／69），Her2 受體陽性型陽性表達率為32.1%（9/28），TNBC 亞型陽性表達率為77.8%（14/18，表1）。不同分子亞型兩兩相比較發(fā)現(xiàn)，與TNBC亞型相比較，Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2 受體陽性型中JunD 的陽性表達明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.019，P=0.003，P=0.030，P=0.003），其余各亞型之間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表2）。

表1 JunD 蛋白在不同的乳腺組織中的表達情況及與臨床病理指標的關系Table 1 The expression of JunD in different breast tissues and its clinical significance

3 討論

乳腺癌是一種高度異質性腫瘤，其發(fā)病的相關分子機制尚未明確，其發(fā)生發(fā)展是一系列基因共同協(xié)作的漸進性累積過程。隨著分子生物學領域的發(fā)展，越來越多的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，為其預后判斷、治療方案的選擇提供了更全面的依據(jù)。

圖2 JunD 在浸潤性乳腺癌不同分子亞型中有代表性的染色情況Fig.2 Representative immunohistochemical staining of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

表2 JunD 在不同分子亞型乳腺癌組織中的表達Table 2 The expression of JunD in different subtypes of Invasive ductal carcinoma tissues

JunD 蛋白是由JunD 基因編碼，由347 個氨基酸組成的分子量約為35 ku 的AP-1 轉錄因子。JunD 作為AP-1 家族成員中重要的一員，JunD 參與腫瘤的增殖、凋亡及分化，在腫瘤的形成過程中起著重要作用［5］。國外研究［6-8］發(fā)現(xiàn)在T 細胞淋巴瘤、B 細胞淋巴瘤及惡性膠質瘤的癌細胞中，JunD的蛋白呈現(xiàn)出異常表達；在人類口腔癌、前列腺癌及胃腸道腫瘤中，JunD 均有其相關的基因作用機制調控腫瘤的進展［9-11］。以上文獻顯示JunD 通過各種調控機制在各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，然而對于JunD 在乳腺癌中的研究鮮少見。本研究發(fā)現(xiàn)JunD 在浸潤性乳腺癌中表達水平明顯低于乳腺正常組織及乳腺增生性病變中的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示JunD 有助于維持乳腺組織正常生長，JunD 表達缺失促進腫瘤的發(fā)生。Toullec［12］等研究提示JunD 的表達缺失激活了腫瘤反應基質，促進乳腺癌的發(fā)生，JunD 在乳腺癌中低表達，本研究結果與Toullec 是一致的。JunD 蛋白協(xié)調細胞正常增殖、分化及轉化等過程，下調JunD 會影響細胞的正常成熟和分化，促進細胞增殖；JunD 能夠阻遏Ras 介導的癌化過程，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，激活細胞分化［13-15］。本研究結果也發(fā)現(xiàn)JunD 在浸潤性乳腺癌組織學Ⅰ級（高分化）中的陽性表達水平明顯高于組織學Ⅱ級-Ⅲ級組（中-低分化），表明了JunD的表達與腫瘤惡性程度有關，隨著惡性等級增高，其陽性率逐漸降低，JunD 高表達的乳腺癌細胞分化往往較好，JunD 在乳腺癌中是預后較好的指標，與上述文獻預測一致。本研究其他結果發(fā)現(xiàn)JunD在乳腺癌中的表達與腫物直徑大小、年齡、淋巴結轉移、ER、PR 及臨床分期無關（P＞0.05），結果與目前文獻報道有一點差異。Chen 等［16］發(fā)現(xiàn)在體外人類乳腺癌細胞株中，JunD 蛋白與JunB蛋白協(xié)同作用，選擇性降低芳香化酶的活性，抑制雌激素的合成，而本研究發(fā)現(xiàn)JunD 的表達與ER、PR 的表達無明顯相關；Detry 等［17］發(fā)現(xiàn)在人類乳腺癌細胞株MCF-7 中，JunD 蛋白能識別并結合BSP 啟動子的cAMP 應答原件（cAMPresponse element，CRE），過表達JunD 增強BSP 啟動子活性，上調BSP 的表達，促進乳腺癌的發(fā)生及骨轉移，而本研究結果提示JunD 的表達與淋巴結轉移無關。這些差異可能與JunD 一大特點有關即為在所有的細胞類型中JunD 都是組成性表達，上述研究都是在體外細胞系中JunD 對細胞遷移及雌激素的影響，而在乳腺癌患者復雜體系中可能存在其他JunD 相關基因組成性表達，例如通過激活乳腺癌標志物LY6K 的表達進而促進乳腺癌轉移，降低生存率［2］，進而導致結果有一些差異，JunD 在浸潤性乳腺癌中的這些具體相關機制有待后期進一步研究。

JunD 在浸潤性乳腺癌分子亞型的中的表達情況及相關作用，國內外文獻報道較少見。Wayne 等［18］發(fā)現(xiàn)浸潤性乳腺癌TNBC 亞型/basallike 中總是會出現(xiàn)JunD 高表達，JunD 在TNBC 亞型中可能起著重要作用。有研究者［19-20］發(fā)現(xiàn)50%浸潤性乳腺癌TNBC 亞型存在各種各樣的角蛋白的高表達，JunD 存在其中一種角蛋白KRT5 的結合位點，他們常常組成性高表達，JunD 的高表達激活了TNBC 亞型中TGFBR3-JUND-KRT5 信號通路等，JunD 在TNBC 亞型中充當重要角色。本研究也發(fā)現(xiàn)JunD 在TNBC 亞型陽性表達率高達77.8%，而在Luminal A 型為40.9%，Luminal B 型（Her2-）為30.4%，Luminal B 型（Her2+）陽性表達率為49.3%，Her2 受體陽性型為32.1%。兩兩比較，TNBC 亞型表達水平明顯高于Luminal A 型、Luminal B 型（Her2-）、Luminal B 型（Her2+）、Her2受體陽性型中的表達，相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各亞型之間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這與上述文獻的研究結果是一致。2013 年St Gallen［3］國際乳腺癌會議共識將 乳腺癌 分為5 型：Luminal A 型，Luminal B 型（Her2-），Luminal B 型（Her2+），Her2 受體陽性型，TNBC 亞型（basal-like），該分類方法更精確的反應乳腺癌的生物學行為，提高了預后判斷的準確性，有利于個體化治療。Luminal A 型及Luminal B型可以化療和內分泌治療，預后較好；Her2 受體陽性型目前可以分子靶向治療；而TNBC 亞型惡性程度高，容易復發(fā)及轉移早，內分泌治療效果差，缺乏有效的分子靶向治療，預后很差。湯謐等［21］研究提出Runx2 樹突狀細胞基因疫苗可能可以特異性殺傷TNBC 亞型細胞，對其個性化治療中起到一定的作用，但目前對于這種的靶向治療尚不完善，缺乏有效可行的方法。所以我們認為，對于目前相對缺乏治療方法的浸潤性乳腺癌TNBC亞型來說，JunD在其中的高表達為靶向治療提供了一定的研究方向，深入研究JunD 在TNBC亞型中的作用機制，有可能為浸潤性乳腺癌TNBC亞型的個性化靶向治療提供一定的幫助。

綜上所述，JunD 在乳腺癌中的陽性表達率為45.6%，明顯低于乳腺增生組織及正常乳腺組織，聯(lián)合檢測JunD 在乳腺組織中的表達情況，有利于乳腺良惡性病變的鑒別診斷。JunD 在浸潤性乳腺癌TNBC 亞型中顯著高表達，有望為TBNC 亞型乳腺癌患者個性化靶向治療研究提供一定方向，但其相關分子機制有待進一步研究。

衷心感謝陳昂副主任醫(yī)師幫忙審核統(tǒng)計方法；衷心感謝陳志強副主任技師指導切片及染色。