三七皂苷R1對心房顫動大鼠心肌炎癥相關(guān)因子和金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)的影響

康玲玲，高端敏

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院心內(nèi)科四科，河北唐山 063000）

心房顫動致殘率和致死率比較高，是臨床常見的心律失常，心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是心房顫動的主要發(fā)病機(jī)制，因此心房顫動的治療重點是抑制心房的電重構(gòu)以及結(jié)構(gòu)重構(gòu)［1］。纖維化形式的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)是心房顫動發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)，抑制心房纖維化、干預(yù)心房重構(gòu)進(jìn)程是未來治療心房重構(gòu)的切入點［2］。細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為心肌炎癥相關(guān)因子，可導(dǎo)致心肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，增加交感神經(jīng)密度，損傷心肌細(xì)胞膜，從而誘導(dǎo)心律失常的發(fā)生［3-4］。金屬基質(zhì)蛋白酶（metalloproteinase，MMP）和金屬基質(zhì)蛋白酶抑制因子（metalloproteinase inhibitor，TIMP）在心房顫動心肌纖維化的過程中發(fā)揮重要作用，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要蛋白水解系統(tǒng)，MMP2 和TIMP2 參與多種心血管疾病的發(fā)生，和心肌纖維化關(guān)系密切［5］。三七為我國的傳統(tǒng)中藥材［6］，三七總皂苷為三七主要有效成分，在心腦血管疾病的防治中具有重要作用，具有抗心律失常，具有防止心房顫動的發(fā)生和降低期前收縮的發(fā)生率［7］，但其作用機(jī)制尚不清楚。三七皂苷R1 為三七總皂苷的主要活性單體之一，本文對三七皂苷R1 對心房顫動大鼠血清和心房組織中ICAM-1、TNF-α、MMP2、TIMP2 的影響進(jìn)行研究，探討三七皂苷R1 防治心房顫動的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑

實驗動物：12 周齡、健康、清潔級、雌雄各半、體質(zhì)量190～240 g、SD 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，按照《實驗動物飼養(yǎng)和使用指南》對大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，保持環(huán)境濕度為40%～70%，環(huán)境溫度為21 ℃～25 ℃，大鼠進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)。動物許可證號：SCXK（京）2014-000。

主要試劑：三七皂苷R1（北京索萊寶生物科技有限公司），ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 ELISA 試劑盒（美國Sigma 公司），Masson 試劑盒、RIPA 裂解液、免疫組化試劑盒（美國Abcam 公司），兔抗鼠MMP-2 多克隆抗體、兔抗鼠TIMP-2多克隆抗體、兔抗鼠ICAM-1 多克隆抗體、兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、兔抗鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體（美國Abcam 公司）等。

1.2 大鼠初篩

將SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，水合氯醛麻醉，生物信號采集處理系統(tǒng)（MwdLab-U/4C501H）描記心電圖，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，將大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣（0.1 mL/100 g），注射后大鼠心電圖顯示出現(xiàn)f 波、P 波消失、R-R 間期絕對不等的心房顫動心電圖，則表示大鼠對乙酰膽堿-氯化鈣敏感［8］。篩選出對乙酰膽堿-氯化鈣敏感的大鼠102 只用于實驗。

1.3 大鼠分組及心房顫動模型建立

將篩選的102 只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、心房顫動組和三七皂苷R1 組，每組34 只。心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠建立心房顫動模型［8］：稱取大鼠體質(zhì)量，水合氯醛麻醉，生物信號采集處理系統(tǒng)記錄大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，大鼠尾靜脈注射0.1 mL/100 g 乙酰膽堿-氯化鈣（含66 μg/mL乙酰膽堿和50 mg/mL 氯化鈣），對照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，每天1 次，共3 d。3 d 用藥結(jié)束后分析心電圖，以心電圖顯示典型心房顫動心電圖為心房顫動大鼠模型建立成功。建模結(jié)束后，對照組大鼠顯示正常心電圖，心房顫動組和三七皂苷R1 組均顯示典型的心房顫動心電圖，表示心房顫動模型建造成功（圖1）。

1.4 各組大鼠處理

建立模型后次日（第4天），三七皂苷R1組大鼠腹腔注射2 mL 三七皂苷R1 水溶液（2.5 mg·kg-1·d-1）［7］，對照組和心房顫動組腹腔注射等量生理鹽水；0.5 h 后，心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠尾靜脈注射0.1 mL/100 g 乙酰膽堿-氯化鈣，對照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。各組取17 只大鼠用于心房顫動持續(xù)時間和心房組織Masson 染色及免疫組化染色測定，各組剩余17 只大鼠用于ELISA 及心房組織Western blotting 測定。

圖1 正常心電圖和心房顫動心電圖表現(xiàn)Fig.1 ECG of normal and atrial fibrillation

1.5 心房顫動持續(xù)時間測定

記錄大鼠第4 天三七皂苷R1 治療前和用藥結(jié)束2 h（治療后）標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以出現(xiàn)典型心房顫動心電圖（出現(xiàn)f 波、P 波消失）為心房顫動開始標(biāo)志，以f 波消失、P 波出現(xiàn)、恢復(fù)竇性心律為心房顫動終止標(biāo)志，心房顫動持續(xù)時間為心房顫動開始至心房顫動終止持續(xù)的時間。

1.6 心房組織病理學(xué)檢查

大鼠心房顫動持續(xù)時間測定結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，開胸取出心臟，清洗干凈后剪取心房組織，多聚甲醛固定3 d，經(jīng)脫水、石蠟包埋。

Masson 染色：將心房組織石蠟切片脫蠟至水，滴加核染液染核60 s，蒸餾水沖洗，滴加漿染液染色60 s，滴加分色液分色8 min，加入復(fù)染液復(fù)染5 min，脫水后，經(jīng)二甲苯透明、中性樹膠封固。心肌組織被染成紅色，心肌膠原纖維被染成藍(lán)色。

免疫組化染色：取心房組織石蠟切片切除4 μm 切片，脫蠟至水，加入檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，加入過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，加入正常山羊血清孵育20 min，加入一抗（兔抗鼠MMP-2多克隆抗體、兔抗鼠TIMP-2 多克隆抗體）過夜孵育，加入二抗孵育20 min，加入鏈親和素-辣根過氧化物酶10 min，加入DAB 工作液5 min，加入蘇木素復(fù)染5 min，加入鹽酸酒精分化2 s，返藍(lán)水洗2 min，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察染色情況，包括陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和染色面積，采用Image-pro llius 圖像處理軟件計算積分光密度值，每張切片選5 個高倍視野測定視野面積和記分光密度，計算光密度（平均光密度=積分光密度/視野面積）。

1.7 血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2水平測定

抽取大鼠尾靜脈血3 mL，離心（2 000 r/min，r=20 cm）20 min，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2和TIMP-2水平。

1.8 大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平測定

采用Western blotting 測定大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平，大鼠抽血結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，開胸取出心臟，清洗干凈后剪取心房組織，將心房組織勻漿后加入裂解液，提取心房組織總蛋白，加入十二烷基硫酸鈉緩沖液煮沸10 min 變性，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉，加入一抗唾液孵育，加入二抗孵育2 h，以β-actin 為內(nèi)參。采用Image lab software 軟件采集條帶灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，大鼠心房顫動持續(xù)時間、血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2水平、心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平、心房組織MMP-2 和TIMP-2 蛋白光密度值符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用t檢驗兩組比較采用成組t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSDt檢驗，取P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三七皂苷R1 組對大鼠心房顫動持續(xù)時間的影響

三七皂苷R1 治療前，兩組心房顫動持續(xù)時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，三七皂苷R1 組心房顫動持續(xù)時間低于治療前和心房顫動組（P＜0.05）；三七皂苷R1組治療前后心房顫動持續(xù)時間差值高于心房顫動組（P＜0.05；表1）。

表1 心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠心房顫動持續(xù)時間比較Table 1 Comparison of duration of atrial fibrillation in model group and PN R1 group （，n=17）

表1 心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠心房顫動持續(xù)時間比較Table 1 Comparison of duration of atrial fibrillation in model group and PN R1 group （，n=17）

1）Compared with Before treatment，P＜0.05

2.2 三七皂苷R1 對大鼠心房纖維化的影響

Masson 染色顯示：對照組大鼠心房肌間質(zhì)膠原纖維量正常，肌纖維和細(xì)胞質(zhì)呈暗紅死，無壞死灶；心房顫動組大鼠心房肌間質(zhì)見融合狀壞死灶內(nèi)有大量膠原纖維；三七皂苷R1 組大鼠心房肌間質(zhì)見片、點狀膠原纖維（圖2）。

2.3 三七皂苷R1 對大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 水平的影響

與對照組比較，心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平升高（P＜0.05），TIMP-2 水平降低（P＜0.05）；與心房顫動組比較，三七皂苷R1 組大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平降低（P＜0.05），TIMP-2 水平升高（P＜0.05；表2）。

2.4 三七皂苷R1 對大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平的影響

與對照組比較，心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平升高（P＜0.05）；與心房顫動組比較，三七皂苷R1 組大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平降低（P＜0.05；表3、圖3）。

圖2 三組大鼠心房組織Masson 染色Fig.2 Masson staining of atrial tissue in three groups of rats

表2 三組大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 水平比較Table 2 Comparison of serum ICAM-1，TNF-α，MMP-2 and TIMP-2 levels in three groups of rats （，n=17）

表2 三組大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 水平比較Table 2 Comparison of serum ICAM-1，TNF-α，MMP-2 and TIMP-2 levels in three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05，2）compared with Model group，P＜0.05.ICAM-1：intercellular adhesion molecule-1；TNF-α：tumor necrosis factor-α；MMP-2：metalloproteinase-2；TIMP-2：metalloproteinase-2 inhibitor

表3 三組大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平比較Table 3 Comparison of ICAM-1，TNF-α and type I collagen levels in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

表3 三組大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白水平比較Table 3 Comparison of ICAM-1，TNF-α and type I collagen levels in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05；2）compared with Model group，P＜0.05；ICAM-1：intercellular adhesion molecule-1；TNF-α：tumor necrosis factor-α

2.5 三七皂苷R1 對大鼠心房組織MMP-2 和TIMP-2 蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示：心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠心房組織中MMP-2 陽性表達(dá)高于對照組，TIMP-2 陽性表達(dá)低于對照組；三七皂苷R1 組大鼠心房組織中MMP-2 陽性表達(dá)低于心房顫動組，TIMP-2 陽性表達(dá)高于心房顫動組（圖4、5）。

與對照組比較，心房顫動組和三七皂苷R1 組大鼠心房組織MMP-2 蛋白光密度值升高（P＜0.05），TIMP-2 蛋白光密度值降低（P＜0.05）；與心房顫動組比較，三七皂苷R1 組大鼠心房組織MMP-2 蛋白光密度值降低（P＜0.05），TIMP-2 蛋白光密度值升高（P＜0.05；表4）。

圖3 三組大鼠心房組織ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型膠原蛋白Western blot 電泳圖Fig.3 Western blot electrophoresis of ICAM-1，TNF-α and type I collagen in three groups of rat atrial tissue

3 討論

心房顫動是最常見的心律失常類型，可導(dǎo)致心力衰竭和腦卒中等致殘、致死性并發(fā)癥的發(fā)生，對患者的生命健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［9］。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在心房顫動中起重要作用，心房纖維化、心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化、心房擴(kuò)大是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要表現(xiàn)，心房纖維化是心房顫動患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的最主要表現(xiàn)，是心房顫動發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，抑制心房纖維化對抑制心房顫動具有重要作用［10］。膠原蛋白是心房組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在心肌成纖維細(xì)胞受到刺激時刻合成和分泌膠原，使膠原合成和膠原降解失去平衡，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量增加，膠原的大量聚集以及排列紊亂可造成心房纖維化的發(fā)生，Ⅰ型膠原蛋白在心房纖維化時合成和分泌異常增加，是心房顫動過程中細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量升高的主要原因，細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白含量和心房纖維化程度關(guān)系密切［11］。本研究顯示Masson 染色見對照組心房肌間質(zhì)膠原纖維量正常，心房顫動組大鼠心房肌間質(zhì)見融合狀壞死灶內(nèi)有大量膠原纖維，心房組織中Ⅰ型膠原蛋白含量高于對照組。表明心房顫動大鼠模型心房組織中存在明顯纖維化。

圖4 三組大鼠心房組織MMP-2 蛋白免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of MMP-2 protein in three groups of rat atrial tissue

圖5 三組大鼠心房組織TIMP-2 蛋白免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of TIMP-2 protein in three groups of rat atrial tissue

表4 三組大鼠心房組織MMP-2 和TIMP-2 蛋白光密度值比較Table 4 Comparison of optical density values of MMP-2 and TIMP-2 proteins in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

表4 三組大鼠心房組織MMP-2 和TIMP-2 蛋白光密度值比較Table 4 Comparison of optical density values of MMP-2 and TIMP-2 proteins in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05；2）Compared with Model group，P＜0.05；MMP-2：metalloproteinase-2；TIMP-2：metalloproteinase-2 inhibitor

表5 小鼠血清脂質(zhì)含量Table 5 Serum lipid，lipoprotein

ICAM-1 是一類存在于細(xì)胞表面的糖蛋白受體，具有促進(jìn)細(xì)胞和細(xì)胞及組織基質(zhì)之間的黏附作用，在血液中白細(xì)胞游出、黏附和浸潤中發(fā)揮重要作用，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，維護(hù)組織穩(wěn)定，在損傷修復(fù)、血栓形成、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用；ICAM-1 下心房顫動的發(fā)生發(fā)展中可導(dǎo)致心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，誘發(fā)心房顫動的發(fā)生［12］。TNF-α由中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，抑制纖溶，促進(jìn)凝血，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。TNF-α和心房顫動關(guān)系比較密切，心房顫動心房組織中TNF-α水平升高，心房顫動心房組織中TNF-α高表達(dá)可影響膠原代謝，在心房間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用，和心房顫動的發(fā)生及維持關(guān)系密切［13］。本研究顯示：心房顫動組大鼠血清和心房組織中ICAM-1 和TNF-α水平升高，表明ICAM-1和TNF-α在誘導(dǎo)大鼠心房顫動的過程中發(fā)揮重要作用。

MMP-2 和TIMP-2 在組織纖維化過程中發(fā)揮重要作用，正常情況下MMP-2 和TIMP-2 處于平衡狀態(tài)，維持正常的細(xì)胞外基質(zhì)。在病理情況下，MMP-2 活性升高，表達(dá)量增加，降解正常的細(xì)胞外基質(zhì)成分，合成異常結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)締組織和膠原蛋白，導(dǎo)致組織重塑［14］。TIMP-2 是MMP-2的抑制劑，其作用和MMP-2 相反，可抑制MMP-2對細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解［15］，TIMP-2 和MMP-2的平衡決定心臟基質(zhì)合成和降解處于平衡狀態(tài)，在心臟結(jié)構(gòu)和功能維持方面發(fā)揮重要作用［16］。本研究顯示：心房顫動組大鼠血清和心房組織中MMP-2 水平升高，TIMP-2 水平降低，表明在大鼠心房顫動的形成過程中MMP-2 和TIMP-2 失去平衡，心房組織細(xì)胞外基質(zhì)成分降解增加，異常膠原蛋白合成增加，從而導(dǎo)致心肌纖維化，引起心房顫動的發(fā)生。

三七是我國傳統(tǒng)中藥，為五加科草本植物三七的根，具有消腫止痛和活血化瘀功效。三七總皂苷是三七的有效活性成分［17］，對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用，對心肌缺血、高血壓、動脈粥樣硬化、腦血管疾病、心律失常等多種疾病具有預(yù)防和治療作用［18-20］；可通過調(diào)節(jié)心肌組織中miRNA 的表達(dá)改善心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，從而預(yù)防心房顫動的發(fā)生［21］。三七皂苷R1 是三七總皂苷的活性單體，其對心腦血管等系統(tǒng)疾病具有防治作用。吳丹丹等對三七總皂苷對乙酰膽堿-氯化鈣誘導(dǎo)大鼠心房顫動及期前收縮的干預(yù)作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可通過抑制血清IL-17A 水平抑制炎癥反應(yīng)而抑制乙酰膽堿-氯化鈣誘導(dǎo)大鼠心房顫動及期前收縮的發(fā)生［22］。本文通過三七皂苷R1 對心房顫動大鼠血清和心房組織ICAM-1、TNF-α、MMP-2、TIMP-2 水平進(jìn)行研究治療，探討三七皂苷R1 對心房顫動的可能作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與心房顫動組大鼠比較，三七皂苷R1組大鼠心房顫動持續(xù)時間減少；心房組織中膠原纖維和Ⅰ型膠原蛋白含量明顯減少，血清和心房組織中ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平降低，TIMP-2水平升高。表明三七皂苷R1 具有防治心房顫動的作用，其機(jī)制可能為三七皂苷R1 通過抑制心肌炎癥相關(guān)因子ICAM-1、TNF-α，減輕對心肌細(xì)胞膜的損傷，降低交感神經(jīng)密度，抑制導(dǎo)致心肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而抑制心房顫動的發(fā)生；三七皂苷R1 通過抑制MMP-2 表達(dá)，促進(jìn)TIMP-2 表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制心肌纖維化，從而抑制心房顫動的發(fā)生。

綜上所述，三七皂苷R1 可能通過抑制心肌炎癥相關(guān)因子ICAM-1、TNF-α表達(dá)，下調(diào)MMP-2 表達(dá)及上調(diào)TIMP-2 表達(dá)抑制心肌纖維化，從而對心房顫動發(fā)揮防治作用。