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    基于氣相色譜質(zhì)譜的脂肪萎縮小鼠血漿代謝組學(xué)研究

    2019-09-10 05:56:29吳琪吳雅韻韋世杰余玉英
    世界中醫(yī)藥 2019年1期
    關(guān)鍵詞:代謝組學(xué)

    吳琪 吳雅韻 韋世杰 余玉英

    摘要目的:脂肪萎縮是引起糖脂代謝紊亂的重要因素之一。通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)技術(shù)分析aP2nSREBP1c脂肪萎縮小鼠血漿代謝譜的變化,研究與其密切相關(guān)的差異代謝物與代謝通路,探討其生物學(xué)基礎(chǔ)。方法:應(yīng)用GCMS技術(shù)對6只同窩野生型小鼠和6只轉(zhuǎn)基因小鼠血漿樣品進(jìn)行檢測,對檢測結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,篩選出顯著差異的代謝物,借助MetaboAnalyst分析代謝通路。結(jié)果:與野生型(wildtype,WT)小鼠比較,轉(zhuǎn)基因(transgenic,TG)小鼠血漿中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)3條脂肪萎縮相關(guān)通路。結(jié)論:通過對aP2nSREBP1c小鼠血漿代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成,丙酮酸代謝,磷酸肌醇代謝途徑與脂肪萎縮相關(guān),為闡明糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制提供了代謝組學(xué)依據(jù)。

    關(guān)鍵詞脂肪萎縮;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用;代謝組學(xué)

    中圖分類號:R917文獻(xiàn)標(biāo)識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.009

    脂肪萎縮是一種異質(zhì)性、遺傳性或獲得性疾病,主要特征是身體脂肪的選擇性喪失[1]。過量的脂肪累積或組織萎縮導(dǎo)致脂肪對脂質(zhì)的儲存能力不足,引起外周組織脂毒性損傷和低度炎性反應(yīng),增加糖尿病和動脈粥樣硬化等糖脂代謝性疾病風(fēng)險[2]。近年來國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對肥胖癥進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了許多與肥胖相關(guān)的代謝標(biāo)志物[35],但是在脂肪萎縮的代謝組學(xué)方面的研究是缺乏的。事實上,脂肪萎縮的遺傳突變表型在代謝綜合征中并不罕見;脂肪萎縮與肥胖可同時發(fā)生,其代謝后果相似可能疊加[67]。因此,研究脂肪萎縮下小分子代謝物的變化有利于更加全面認(rèn)識糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制,并在此基礎(chǔ)上研發(fā)防治策略和藥物。

    近年來,代謝組學(xué)的快速發(fā)展為生命科學(xué)的研究提供許多便捷,它能定量檢測生物體在病理生理刺激或遺傳環(huán)境因素改變下所產(chǎn)生的動態(tài)變化,對于明晰機體發(fā)生的代謝變化指出方向。目前,多種分析技術(shù)應(yīng)用于代謝組學(xué)研究,而GCMS的應(yīng)用較為廣泛,其特點包括較高檢測靈敏度和可供參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫,能夠定性分析代謝產(chǎn)物[8]。aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠具有白色脂肪少,棕色脂肪肥大的特點。隨年齡增加,肝臟脂肪異位沉積逐漸加重,并且伴有嚴(yán)重的胰島素抵抗問題[9]。由于糖脂代謝紊亂和脂肪生成分化障礙,該小鼠曾用作先天遺傳引起的脂肪萎縮癥或糖尿病研究[1011]。本實驗主要借助GCMS儀器對aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿樣品進(jìn)行代謝組學(xué)檢測與分析,旨在探究脂肪萎縮條件下血漿代謝物的變化,現(xiàn)報道如下。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1動物aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠由美國Jackson實驗室引進(jìn),委托南京大學(xué)模式動物研究所凈化,動物合格證編號:J003393 SCXK(蘇)20100001。動物實驗期間均飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)繁殖條件:SPF級動物房,溫度20~25 ℃,濕度40%~70%,12 h:12 h晝夜間斷照明,進(jìn)食普通飼料,自由飲食飲水。

    1.1.2試劑與儀器渦旋混合器(德國IKA公司);臺式高速冷凍離心機(美國SCILOGEX公司);DK8D電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);HGC24A型氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);Agilent 7890B/5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。甲醇(色譜純,德國Merck公司);甲氧胺鹽酸鹽(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,F(xiàn)1601013);吡啶(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);N,O雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(87VMHMM,東京化成工業(yè)株式會社);正庚烷(分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);超純水。

    1.2方法

    1.2.1動物分組aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠是C57BL/6J和SJL背景的雜合子個體,參照J(rèn)ackson實驗室基因型鑒定方法鑒定轉(zhuǎn)基因型和野生型,根據(jù)基因型把小鼠分為WT組和TG組。

    1.2.2檢測指標(biāo)與方法

    1)脂肪組織形態(tài)觀察:經(jīng)乙醚麻醉側(cè)眼底靜脈叢取血后處死小鼠,迅速分離脂肪組織,置于4%多聚甲醛固定過夜,石蠟包埋,切片,HE染色,進(jìn)行病理形態(tài)觀察分析。

    2)血漿樣品獲取與前處理:10周齡小鼠12 h禁食后經(jīng)乙醚麻醉,側(cè)眼底靜脈叢取血,肝素鈉抗凝,離心(3 000 r/min,4 ℃,15 min)取血漿。吸取50 μL新鮮血漿于離心管中,加入200 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì),渦旋混勻1 min,離心10 min(15 000 r/min,4 ℃),取上清液200 μL氮氣吹干。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL,混勻,在70 ℃下肟化1 h。加入50 μL BSTFA(含1%TMCS),在70 ℃水浴下衍生化1 h。加入50 μL正庚烷,渦旋混勻后離心移取上清至微量進(jìn)樣管,待GCMS分析。

    3)測定條件:色譜柱:HP5MS(60 m×250 μm×0.25 μm);進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣口溫度:260 ℃;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣。升溫程序:起始溫度60 ℃,保持1 min,以8 ℃/min升至100 ℃,保持5 min,以15 ℃/min升至170 ℃,保持5 min,以10 ℃/min升至210 ℃保持2 min,以15 ℃/min升至350 ℃保持3 min。電離方式:EI;電子轟擊能量:70eV;離子源溫度:230 ℃;四級桿溫度:150 ℃;溶劑延遲:11 min。

    4)數(shù)據(jù)處理及差異代謝物篩選:使用GCMS聯(lián)用儀對血漿樣品進(jìn)行檢測分析,經(jīng)過積分后利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫(NIST)進(jìn)行化合物比對。將比對后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/)在線分析網(wǎng)站,采用無監(jiān)督模式識別的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)觀察各組分分離趨勢,根據(jù)倍數(shù)變化>1.5和P<0.05篩選差異代謝物[12],以匹配分?jǐn)?shù)大于80的鑒定結(jié)果作為可信結(jié)果。

    1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS軟件對樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析,2組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用MetaboAnalyst進(jìn)行代謝通路富集分析,鑒別出2組間差異顯著的代謝通路。

    2結(jié)果

    2.1表型評價白色脂肪病理切片觀察HE染色中,細(xì)胞質(zhì)的脂肪被溶解呈空泡狀,細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)。與野生型(WT)小鼠比較aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠白色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴較少且體積較小。TG小鼠白色脂肪呈萎縮狀態(tài)。見圖1。

    2.2血漿非靶向代謝組學(xué)TIC圖采用GCMS技術(shù)對小鼠血漿進(jìn)行分析,得到血漿代謝物的總離子流圖,從中得到樣品的化合物信息,質(zhì)譜信息,離子豐度等。結(jié)果顯示2組樣本多數(shù)代謝物的出峰時間集中在12~37 min,但在峰信號和峰數(shù)目上存在差別,TG組的峰信號明顯強于WT組,表明2組的血漿代謝輪廓存在一定差異。見圖2。

    2.3主成分分析(PCA)PCA分析是一種無監(jiān)督模式識別的多元變量統(tǒng)計分析方法,可以通過降維的方式,反映出高維數(shù)據(jù)樣本之間的差異。結(jié)果如圖3所示,PCA得分圖上WT與TG樣本點分散于不同區(qū)域,說明正常WT小鼠與TG小鼠血漿內(nèi)源性代謝物具有差異。

    2.4差異代謝物的篩選結(jié)果本研究共篩選出11種差異代謝產(chǎn)物,與WT比較,TG組中乳酸、L纈氨酸、3羥基丁酸、尿素、d半乳糖、D阿洛糖、硬脂酸、棕櫚酸、肌醇、油酸、11十八碳烯酸含量增加。見表1、圖4。

    2.5代謝產(chǎn)物通路分析將11種差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst進(jìn)行在線數(shù)據(jù)處理分析。圖中每個圓圈對應(yīng)相關(guān)的通路,圓圈的著色代表代謝物在數(shù)據(jù)中具有不同程度的顯著性,著色越深,差異越大;反之,差異越小。根據(jù)通路影響值(pathway impact>0.1)得到:纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成,丙酮酸代謝,磷酸肌醇代謝,共3條與脂肪萎縮相關(guān)的代謝通路。見圖5。

    3討論

    實驗以aP2nSREBP1c轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象,應(yīng)用GCMS技術(shù)對血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)研究,共篩選出11個差異代謝物(包括氨基酸、脂肪酸、糖)。這些代謝物在脂肪萎縮小鼠血漿中顯著上調(diào),表明小鼠體內(nèi)發(fā)生了代謝紊亂。通路富集表明差異代謝物在體內(nèi)主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成,丙酮酸代謝,磷酸肌醇代謝途徑。

    纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成屬于支鏈氨基酸(Branched Chain Amino Acids,BCAA)的生物合成途徑。BCAA是一種特殊的必需氨基酸。研究認(rèn)為,BCAA能夠激活雷帕霉素(the Mammalian Target of Rapamycinm,mTOR)靶點引起胰島素抵抗[1314]。機體中BCAA缺乏時,白色脂肪內(nèi)硬脂酰輔酶a、脂肪酸合酶均被抑制,棕色脂肪組織內(nèi)解耦聯(lián)蛋白1表達(dá)水平增加,產(chǎn)熱耗能增強,脂肪含量快速減少,機體呈現(xiàn)消耗表型[1516]。此外,BCAA被證明可以通過mTOR信號在下丘腦的水平上調(diào)節(jié)脂肪的瘦素分泌和食物攝入[17]。本研究中纈氨酸在轉(zhuǎn)基因小鼠中的血漿代謝水平顯著升高,這可能與小鼠脂肪因子信號通路受損相關(guān)[18]。

    肌醇參與了磷酸肌醇的代謝途徑。肌醇是許多二級信使的前體分子,由葡萄糖合成,是磷脂酰肌醇的組成部分。在胰島素發(fā)揮作用的過程中,磷脂酰肌醇是重要的遞質(zhì),參與多種信號的傳遞。乳酸參與丙酮酸代謝途徑。丙酮酸作為物質(zhì)代謝的重要中間體,可通過三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化,是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐。與酮體代謝相關(guān)的3羥基丁酸,與脂肪酸代謝相關(guān)的硬脂酸、油酸、棕櫚酸、11十八碳烯酸,與糖代謝相關(guān)的d半乳糖、D阿洛糖、與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的尿素,血漿代謝水平升高。提示脂肪萎縮可能導(dǎo)致機體的糖脂代謝紊亂,能量代謝異常問題。

    脂肪組織不僅是能量儲備器官,它還是一個具有多種內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌功能的內(nèi)分泌器官,脂肪組織通過分泌多種激素及信號調(diào)節(jié)分子,與胰腺、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等進(jìn)行器官對話[19]。過量的脂肪累積或組織萎縮都將影響全身的代謝。本研究使用的代謝組學(xué)技術(shù)有助于系統(tǒng)了解機體總的病理生理過程,契合中醫(yī)學(xué)“整體觀念,辨證論治”理論。通過該技術(shù)分析脂肪萎縮小鼠的差異代謝物變化及其代謝途徑,能一定程度上反映脂肪萎縮小鼠代謝水平變化,將為闡明糖脂代謝性疾病的發(fā)病機制,研發(fā)該病中醫(yī)藥/中西醫(yī)結(jié)合防治策略和創(chuàng)新藥物,提供代謝組學(xué)的實驗依據(jù)。

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    (2018-12-10收稿責(zé)任編輯:王楊)

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