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    新疆維吾爾族和漢族大學(xué)生尿液代謝輪廓差異分析

    2015-11-03 07:42:21宋培培等
    分析化學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:代謝組學(xué)氣相色譜維吾爾族

    宋培培等

    摘 要 以新疆兩個主要世居民族(維吾爾族和漢族)大學(xué)生人群尿樣為研究對象,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對35名維吾爾族和37名漢族大學(xué)生人群尿樣進行分析,考察兩民族大學(xué)生尿液代謝輪廓間的差異。采用正交信號校正-偏最小二乘法判別分析結(jié)果表明, 維吾爾族和漢族大學(xué)生人群尿樣代謝輪廓存在著明顯差異,聚類明顯。實驗發(fā)現(xiàn)和鑒定出9種差異代謝物,其中7種為內(nèi)源性代謝物,2種為外源性代謝物。研究表明,相關(guān)代謝組學(xué)研究可從源頭避免或減少非疾病因素引入的差異變量,除年齡、性別等因素外,還需充分考慮族別因素的影響。

    關(guān)鍵詞 代謝組學(xué); 氣相色譜-質(zhì)譜; 維吾爾族; 漢族; 尿液

    1 引 言

    代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,已成為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個新的組學(xué)研究熱點[1,2]。在疾病代謝組學(xué)研究中,采樣環(huán)節(jié)起著舉足輕重的作用,生物樣本的代表性與所鑒定出的相關(guān)疾病生物標志物的可靠性與準確性有著直接關(guān)系。眾多因素影響著生物樣本中代謝物的組成與含量,如飲食習(xí)慣、外界壓力、抽煙與否以及參加鍛煉頻率與強度等,導(dǎo)致代謝組學(xué)研究結(jié)果有極大的可變性[3~9]。在動物實驗中,通過嚴格控制外部生理條件,可最大化降低或消除這些因素的影響。但對人類相關(guān)疾病組學(xué)研究過程中,該方法并不可行。如Saito等[4]研究了血液基質(zhì)、年齡和性別對高加索人種代謝物輪廓的影響,證實這些因素均會導(dǎo)致個體間代謝物在種類和數(shù)量的不同;Lenz等[5]發(fā)現(xiàn),由于英國和瑞典健康人群飲食和文化不同,導(dǎo)致尿液輪廓間存在差異,在瑞典健康人群中,Trimethy-lamine N-oxide含量高于英國健康人群;Dumas等[6]發(fā)現(xiàn),由于飲食、基因和腸道微生物因素,日本、芝加哥和中國的健康人群的尿液輪廓存在差異。上述研究表明,人種、飲食文化等差異會對生物樣本中代謝物的組成與含量產(chǎn)生較大影響。新疆地理環(huán)境和自然生態(tài)條件復(fù)雜,民族分布及其生活方式獨特,地方性高發(fā)病種類繁多,并且表現(xiàn)出一定的民族性[10,11]。這除與民族遺傳等基因因素相關(guān)外,民族文化和飲食習(xí)慣的差異也是導(dǎo)致這種現(xiàn)象的一個重要原因。為深入研究新疆地方性高發(fā)病,在進行相關(guān)代謝組學(xué)研究過程中,就必須充分考慮族別因素的影響?;诖?,本研究以新疆兩個人口最多的世居民族維吾爾和漢族為對象,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對這兩個民族健康大學(xué)生尿樣進行分析,探索由于族別因素導(dǎo)致的尿液輪廓間差異,并通過生物統(tǒng)計學(xué)方法發(fā)現(xiàn)和鑒別兩個人群尿樣中差異代謝物,為新疆多發(fā)性疾病早期診斷與相關(guān)標志物的篩選提供參考。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    QP2010 Ultra GC-MS (日本Shimadzu公司),Coulter Avanti J-25 高速冷凍離心機(美國Beckman公司)。

    N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA, 98%,Aladdin 試劑);三甲基氯硅烷(TMCS)、甲氧基胺鹽酸鹽(98%,Alfa Aesar試劑);吡啶(分析純,北京化工廠),十二酸(色譜純,上海試劑一廠)。

    2.2 樣品處理

    2.2.1 樣品收集

    于新疆大學(xué)收集35例(男18、女17)維吾爾族和37例(男16、女21)漢族的大學(xué)生晨起尿樣,年齡19~28歲,志愿者身體健康,一星期之內(nèi)未服用任何藥物,24 h內(nèi)未飲用含咖啡因的飲品。72例樣本收集后,在2 h內(nèi)進行處理,4℃下3000 g離心10 min,除去固形物,上清液置于-80℃保存。

    2.2.2 樣品前處理 尿樣在室溫下解凍混合均勻,取200 μL上清液,按體積比1∶4加入冷丙酮800 μL,4℃靜置5 h,沉淀蛋白;在4℃下12000 g離心15 min,取上清液,冷凍真空干燥。在殘留干燥物中加入34 μL 15 g/L 甲氧胺鹽酸鹽,無水吡啶為復(fù)溶液,渦旋5 min充分溶解后,加入7 μL 5 mg/mL月桂酸標準溶液(內(nèi)標物),另加34 μL衍生化試劑(BSTFA∶TMCS=99∶1)超聲振蕩5 min,使之充分反應(yīng)。37℃衍生30 min,緩慢升溫至65℃, 衍生化反應(yīng)結(jié)束,冷卻至室溫后進行GC-MS分析。

    為檢驗儀器和分析方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,本實驗使用質(zhì)量控制(Quality control, QC)樣品,QC樣品由每例樣品各取適量混合而得,樣品檢測過程中,每檢測7個樣品后運行1次QC樣品,以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

    2.3 色譜-質(zhì)譜條件

    Rxi-5Sil MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度,280℃;分流比,100∶1;載氣,99.999%高純He,1.0 mL/min;色譜柱溫度,初始溫度60℃,保持2 min,以10℃/min由60℃提升至80℃,再以25℃/min升至160℃,以10℃/min升至280℃,保持2 min;進樣量,0.1 μL。

    EI離子源:溫度200℃;電子能量,70 eV;掃描方式,全掃描模式,掃描范圍m/z 50~600。譜庫:Wiley 229.L, Wiley 7.L和NIST 08.L。

    2.4 數(shù)據(jù)處理

    GC-MS產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)首先采用GC-MS Solution軟件進行預(yù)處理,以斜率1000 min,半峰寬為2進行基線校正和自動峰值檢測;以內(nèi)標月桂酸為標準進行歸一化處理后, 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5 Demo和 17.0 SPSS軟件進行多維統(tǒng)計分析。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 生物統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SIMCA-P 11.5 Demo軟件對所得數(shù)據(jù)進行正交信號校正-偏最小二乘法判別分析(Orthogonal signal correction filtered partial least-squares discriminant analysis, OSC-PLS-DA)。如圖1A所示,維吾爾族和漢族大學(xué)生尿樣聚類明顯,兩組樣本達到了良好分離(模型參數(shù)R2X=0.691,Q2(cum)=0.333),說明兩組尿樣輪廓間存在顯著差異。為了檢驗?zāi)P椭噩F(xiàn)性是否良好和模型中的數(shù)據(jù)是否過擬合,避免監(jiān)督性學(xué)習(xí)方法獲得分類結(jié)果的偶然性,每個模型都經(jīng)過100次內(nèi)交叉驗證(Cross validation,CV),結(jié)果見圖1B。CV以R2和Q2回歸線與y軸的截距值作為標準衡量模型是否過擬合。本次實驗結(jié)果中Q2

    為負值(0.232),證實所建模型不存在過擬合,模型有效,預(yù)測能力良好[12],可應(yīng)用于維吾爾族和漢族大學(xué)生尿樣的聚類分析。

    3.2 差異代謝物篩選

    在OSC濾噪的PLS-DA模型中Variable importance in the projection (VIP) 是一種廣泛使用的變量挑選方法[12],VIP間接反映了代謝物和所研究樣本之間的關(guān)系。本研究以VIP>1[13]和顯著性t檢驗p<0.05為標準對代謝物進行了篩選,共鑒定出9種代謝物在維吾爾族和漢族大學(xué)生尿液中存在顯著性差異,所得結(jié)果按VIP由大到小列于表1。

    為進一步驗證所鑒定的差異代謝物的可靠性,分別通過人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Human metabolomics databas,HMDB)、代謝物二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Metabolite and tandem MS databas,METLIN)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等數(shù)據(jù)庫對9種差異代謝物進行檢索,結(jié)果發(fā)現(xiàn),它們均為尿液代謝物,進一步驗證了實驗結(jié)果的可靠性。其中7種差異代謝物為內(nèi)源性物質(zhì)(圖2),主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)代謝途徑。它們在兩組尿樣中的變化趨勢也并不相同,有升有降,而尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的含量與飲食文化或基因等因素有著直接或間接的關(guān)系。乳酸丁酯和丙二醇為外源性代謝物,它們含量的高低與攝入的食物或香精有直接關(guān)系。上述結(jié)果表明,維吾爾族和漢族健康大學(xué)生人群尿樣中存在著多種差異代謝物,導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因與民族文化,特別是飲食文化的差異有關(guān)。

    特別需要說明的是,在兩組尿樣中,α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺在維吾爾族大學(xué)生尿液樣本中含量明顯高于漢族大學(xué)生,其過度表達預(yù)示著患有肝脾氣虛癥的可能性更高[14]。但在本實驗過程中所采集的尿液樣本均來自于年輕的健康大學(xué)生人群,α-N-苯乙酰-L-谷氨酰胺含量偏高并不能說明維吾爾族大學(xué)生比漢族人群患有肝脾氣虛癥的可能性更高,可能只是與民族文化和傳統(tǒng)或民族基因間差異有關(guān),而且新疆實際情況也與這一可能性相反,乙肝攜帶率漢族高于維吾爾族[11]。上述實際結(jié)果說明民族文化和傳統(tǒng)或民族基因的差異也會導(dǎo)致不同族別人群尿液樣本中代謝物的種類和含量存在著差異,會嚴重干擾相關(guān)疾病生物標志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

    References

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