腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8樣分子1在食管癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制研究

王道軍，趙山虎，夏平，吳應(yīng)虎

食管癌是居全球癌癥死亡第六位的惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢[1]。而且我國食管癌的病死率居世界首位，患者早期癥狀不典型，一旦確診常處于晚期，總體5年生存率不到10%[2-3]。腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8樣分子1(TNF-α-induced protein 8-like 1，TIPE1)是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白，在多種腫瘤疾病中異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此逐漸成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。目前研究顯示TIPE1在肺癌、肝癌、骨肉瘤、胃癌組織中低表達(dá)[4-6]，而在食管癌組織中表達(dá)情況未知，因此本研究將探討TIPE1在食管癌組織中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)標(biāo)本來源：2018年1月—2019年1月陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)切除食管癌患者10例，留取癌組織及癌旁正常組織備用。術(shù)前患者未進(jìn)行化放療，且均經(jīng)過病理學(xué)、影像學(xué)確診。(2)細(xì)胞株：食管癌細(xì)胞Eca109購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。(3)試劑及主要儀器：兔抗CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9及GAPDH多克隆抗體購自美國cell signal technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、CCK-8試劑盒、BCA試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gbico公司；TIPE1空白質(zhì)粒及過表達(dá)載體購自上海吉瑪生物有限公司；LipofectamineTM3000，ranswell 小室購自美國Corning公司。TE2000熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀及ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 觀測指標(biāo)與方法

1.2.1 TIPE1過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染：室溫條件下Opti-MEM培養(yǎng)基分別與LipofectamineTM3000、TIPE1空白質(zhì)粒及過表達(dá)載體稀釋混勻后，再將稀釋好的LipofectamineTM3000分別與稀釋好的TIPE1空白質(zhì)粒及過表達(dá)載體混勻，于室溫下放置30 min，使其形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入生長融合度達(dá)到70%的Eca109細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h，換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)至48 h，最后采用Western-blot法檢測細(xì)胞中TIPE1的表達(dá)。

1.2.2 CCK-8檢測Eca109細(xì)胞活力：將Eca109細(xì)胞5×103個(gè)接種于96孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h，加入CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm處測定吸光度，吸光度即代表細(xì)胞的活力。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Eca109細(xì)胞凋亡：將Eca109細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，每組收集1×106/ml個(gè)細(xì)胞，400 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μl在4℃條件下避光孵育15 min，PI染液加入10 μl在4℃條件下避光孵育15 min，并以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Eca109細(xì)胞周期：將Eca109細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，每組收集1×106/ml個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1 ml的DNA染色液及10 μl的PI染色液加入到細(xì)胞中混勻后，在室溫下避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞周期所占的比例。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Eca109細(xì)胞侵襲能力：將matrigel膠平鋪到transwell小室備用。將1×104個(gè)Eca109細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右后，轉(zhuǎn)染48 h，將細(xì)胞消化并接種到transwell上室，下室僅含有10%DMEM培養(yǎng)基，48 h后，將小室取出對下室進(jìn)行染色，首先行多聚甲醛固定10 min，然后結(jié)晶紫室溫避光染色15 min，最后在倒置顯微鏡下對下室的5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，以細(xì)胞侵襲數(shù)目代表細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.6 Western-blot檢測細(xì)胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量：收集Eca109細(xì)胞，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min，1 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液，上清液即總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白定量，制作蛋白濃縮膠和分離膠并室溫靜置30 min后，取30 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行凝膠電泳1～2 h，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜30～40 min。2% BSA室溫下孵育1 h，兔抗(CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9及GAPDH多克隆抗體)一抗溶液4℃過夜孵育，TBST洗滌3次，次日室溫孵育二抗，TBST洗滌3次，滴加化學(xué)曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并分析各目的蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 TIPE1在食管癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá) TIPE1在癌旁正常組織及食管癌組織中蛋白表達(dá)量分別為(0.34±0.02)和(0.13±0.01)，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.698,P=0.000)，見圖1。

圖1 TIPE1在食管癌組織及癌旁正常組織的表達(dá)

2.2 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中TIPE1表達(dá)量的影響 TIPE1過表達(dá)載體及空白質(zhì)粒在Eca109細(xì)胞中表達(dá)量分別為(1.02±0.10)和(0.21±0.02)，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.757,P=0.000)，見圖2。

圖2 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中TIPE1表達(dá)量的影響

2.3 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞活力的影響 與空白質(zhì)粒組(0.48±0.04)比較，TIPE1過表達(dá)組(0.38±0.03)細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.464，P=0.026)。

2.4 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響 與空白質(zhì)粒組比較，TIPE1過表達(dá)組細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率顯著提高，G2期和S期細(xì)胞所占比例顯著降低，而G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，細(xì)胞周期主要阻滯于G1期(P<0.05)，見表1。

2.5 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞侵襲能力的影響 與空白質(zhì)粒組[(158.32±14.33)個(gè)]比較，TIPE1過表達(dá)組[(42.36±4.24)個(gè)]細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著減少(t=13.440，P=0.000)。

2.6 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的影響 與空白質(zhì)粒組比較，TIPE1過表達(dá)組中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(t=10.457、10.922、52.034、46.540、11.585、13.555，P均=0.000)，見圖3～5。

注：與空白質(zhì)粒組比較，aP<0.01

圖3 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中CyclinD1、

CyclinB1蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8)家族是最新發(fā)現(xiàn)的由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組蛋白，包括4個(gè)成員：TIPE，TIPE1、2、3[7-9]。其中TIPE1于2008年被首次發(fā)現(xiàn)，其基因定位于人染色體19p13.3，能夠編碼含有186個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)蛋白，表達(dá)于肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、生殖器細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及各種來源的上皮細(xì)胞，特別是具有分泌功能的器官[10-11]。TIPE1在成熟的T、B淋巴細(xì)胞中不表達(dá)，而在人或者鼠來源的腫瘤細(xì)胞(HEK-293、RAW264.7、MOVAS等)中表達(dá)，提示TIPE1可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[12-14]。目前研究表明TIPE1在肺癌、肝癌、骨肉瘤、胃癌組織中低表達(dá)，而在宮頸癌、皮膚癌組織中高表達(dá)[4-6]，說明TIPE1在腫瘤組織中的表達(dá)具有爭議性，但TIPE1在食管癌組織中的表達(dá)作用未知，因此本課題組據(jù)此展開探討。本研究Western-Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食管癌組織中TIPE1表達(dá)量低于癌旁正常組織，與TIPE1在大多數(shù)腫瘤組織中的表達(dá)趨勢一致，說明TIPE1在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中起抑制作用[15-17]。

表1 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響

注：與空白質(zhì)粒組比較，aP<0.01

圖4 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8蛋白表達(dá)量的影響

注：與空白質(zhì)粒組比較，aP<0.01

圖5 TIPE1過表達(dá)對Eca109細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的影響

有學(xué)者通過生物信息學(xué)軟件對TIPE1結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIPE1在哺乳動(dòng)物中的氨基酸序列保守，并且能夠與FBXW5及Caspase 8等蛋白分子相互作用[6，15]。另外有研究顯示，siRNA干擾TIPE1能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長，而TIPE1過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞生長[15]。同時(shí)Wu等[17]的研究表明TIPE1能夠通過下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549及H292中MMP-2及MMP-9表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；而Chen等[18]的研究也表明，TIPE1在骨肉瘤癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，且TIPE1可通過抑制骨肉瘤細(xì)胞中MCP-1的表達(dá)來抑制巨噬細(xì)胞在骨肉瘤癌細(xì)胞的浸潤。進(jìn)而說明TIPE1對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。因此，本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染TIPE1過表達(dá)載體，并進(jìn)一步探討TIPE1過表達(dá)后對Eac109食管癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明TIPE1過表達(dá)能夠顯著降低Eac109細(xì)胞活力，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，同時(shí)還能夠降低細(xì)胞的侵襲能力。

細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，其中G1、G2、S期是常見抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)[19-21]，G1期是DNA復(fù)制前期，CyclinD1是與G1期最為密切相關(guān)的蛋白，其表達(dá)量在G1期達(dá)到頂峰，并促進(jìn)G1迅速向S期轉(zhuǎn)換。G2期是DNA合成后期，是有絲分裂準(zhǔn)備前期，CyclinB1是與G2期密切相關(guān)的蛋白，其表達(dá)量在G2期達(dá)到頂峰，并啟動(dòng)有絲分裂相關(guān)因子表達(dá)。Caspase家族是一組能夠使細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡的天冬氨酸水解酶，受到上游凋亡信號(hào)刺激后，能使Caspase家族發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，起始凋亡蛋白Caspase 8將凋亡信號(hào)傳遞給凋亡蛋白執(zhí)行者Caspase 3，并最終使DNA斷裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡[22-23]。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要由蛋白水解酶MMPs所介導(dǎo)，其中MMP-2在降解細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成并浸潤[24]。MMP-9是分子量最大的MMPs，能夠降解包括膠原在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而提供細(xì)胞的活動(dòng)能力[25]。因此，本研究繼續(xù)探討TIPE1過表達(dá)對細(xì)胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表達(dá)量的影響，結(jié)果表明TIPE1過表達(dá)能顯著下調(diào)Eac109細(xì)胞中CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞活力，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞侵襲。

綜上所述，TIPE1在食管癌組織中低表達(dá)，提高TIPE1表達(dá)能顯著下調(diào)CyclinD1、CyclinB1、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、MMP-2及MMP-9表達(dá)，進(jìn)而降低Eca109細(xì)胞活力及侵襲能力，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而說明TIPE1可能作為一個(gè)抑癌基因參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，通過過表達(dá)TIPE1抑制食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，可能作為食管癌治療的有效措施，進(jìn)而為TIPE1作為食管癌基因治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。