長鏈非編碼RNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌中的表達及其機制研究

曹暉，張申，劉琦，顧越雷

結(jié)腸癌是胃腸道中常見惡性腫瘤，近年來隨飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的變化，結(jié)腸癌發(fā)生率不斷增加。結(jié)腸癌的發(fā)生是多種癌基因、抑癌基因參與調(diào)控的疾病，其病理機制尚未完全闡明[1-3]。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是包含大于200個核苷酸但不具有蛋白編碼能力的RNA分子，在X染色體沉默、基因組印記、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。關(guān)于lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后判斷中的作用研究日益增多。前期研究通過lncRNA芯片發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中異常表達，然而有關(guān)結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA RP11-110G21.1表達的臨床意義未見研究。因此本研究通過觀察結(jié)腸癌組織及其癌旁組織lncRNA RP11-110G21.1表達差異，并分析其表達與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以及檢測沉默lncRNA RP11-110G21.1后對結(jié)腸癌細胞株增殖、遷移、侵襲的影響，從而研究lncRNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌中的表達情況及其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年8月—2015年12月上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化外科診治結(jié)腸癌患者120例臨床資料，所有病例均為初診，其中男71例，女49例，年齡41～72(56.32±5.16)歲。普查便隱血陽性而無癥狀者56例，解暗紅色血便伴消瘦28例，陣發(fā)性腹痛伴大便習(xí)慣改變19例，出現(xiàn)急性腸梗阻17例，均行腸鏡檢查明確診斷。合并癥：心臟病(心律失常、心肌缺血)46例，糖尿病39例(血糖控制良好)，輕度慢性阻塞性肺疾病13例；有明確家族史者9例。有癥狀者出現(xiàn)癥狀到腸鏡檢查2周～9個月，中位數(shù)16周。所有病例均經(jīng)肺部CT平掃、腹部增強CT或增強MR檢查，排除遠處轉(zhuǎn)移。以手術(shù)過程中切除并凍存的結(jié)腸癌組織為結(jié)腸癌組，距癌組織邊緣≥2 cm的癌旁組織為癌旁組織組，術(shù)前患者均未進行手術(shù)、放化療及免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤；具有嚴重肺功能損傷、大面積心肌梗死、嚴重糖尿病患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。患者術(shù)后定期通過門診復(fù)查及電話隨訪形式隨訪，隨訪時間為3年。

1.2 觀測指標(biāo)與方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA RP11-110G21.1表達： 應(yīng)用TRI試劑提取結(jié)腸癌組織及其癌旁組織標(biāo)本、人正常結(jié)腸上皮細胞(NCM460)、結(jié)腸癌細胞(LoVo)細胞株中的總RNA,應(yīng)用Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用2×SYBR Green PCR MAsterMix，以cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，lncRNA RP11-110G21.1正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’；GAPDH正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct算法計算lncRNA RP11-110G21.1相對表達量。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 細胞株及細胞培養(yǎng)：NCM460及LoVo細胞(購自美國ATCC公司)置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度、5%CO2條件下無菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況定期換液與傳代，3代后進行計數(shù)，進行細胞接種。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期LoVo細胞以4×105/孔接種到細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細胞融合達到80%左右，更換為不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。采用Lipofectamin 2000試劑進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)使用說明書，分別加入lncRNARP11-110G21.1NC(NC組)和lncRNARP11-110G21.1NC inhibitor(inhibitor組)，加入事先裝有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree離心管中，然后加入Lipofectamin 2000試劑4 μl，將質(zhì)粒與對應(yīng)脂質(zhì)體溶液混合，靜置20 min，加入培養(yǎng)孔，另取裝有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree離心管作為空白組。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，提取總RNA及總蛋白供后續(xù)使用。

1.2.4 CCK-8法檢測下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對細胞增殖的影響：取各組細胞，離心棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，吹打混勻，制成細胞懸液，取細胞懸液10 μl，加入含RPMI 1640 1 ml EP管內(nèi)，吹打混勻，取稀釋細胞懸液10 μl，細胞計數(shù)板計數(shù)，以1.0×105個/ml細胞密度接種于12孔板，每孔100 μl，每組3個復(fù)孔。在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入濃度為1.5 mg/ml CCK-8 10 μl，培養(yǎng) 4 h后每孔加入 DMSO 150 μl，分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h讀取吸光度值(OD)，繪制細胞生長曲線，測定時以未接種細胞只加培養(yǎng)基孔的為空白對照調(diào)零。

1.2.5 Transwell小室法檢測下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲的影響：侵襲試驗，收集各組細胞，在上層小室平鋪稀釋為1 μg/μl的Matrigel膠100 μl，37 ℃孵育4 h，計數(shù)后于無血清的DMEM培養(yǎng)液中重懸。上室加入細胞懸液100 μl ，下室加入600 μl 含10 % 胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦除上層小室內(nèi)的細胞和 Matrigel 膠，將細胞與1%多聚甲醛混合固定后用0.1 %結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡[CG1-XDS-1B型，西化儀(北京)科技有限公司]隨機選取5個視野并拍照，進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。遷移試驗除不加入Matrigel膠外，其余步驟與侵襲試驗完全相同。

2 結(jié) 果

2.1 2組lncRNA RP11-110G21.1表達比較 與癌旁組織lncRNA RP11-110G21.1表達水平(1.01±0.15)比較，結(jié)腸癌組織(1.73±0.24)顯著升高(t=27.868，P=0.000)。

2.2 下調(diào)結(jié)腸癌細胞lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響 與NCM460細胞比較，LoVo細胞株lncRNA RP11-110G21.1表達顯著升高(P<0.05)；與空白組、NC組比較，inhibitor組LoVo細胞lncRNA RP11-110G21.1顯著降低(P<0.05)。CCK-8檢測顯示，轉(zhuǎn)染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后，LoVo細胞48 h后增殖較空白組與NC組顯著降低(P<0.05)，3組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=320.875，P<0.01)，見圖1。

2.3 下調(diào)結(jié)腸癌細胞lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲的影響 與空白組比較，NC組遷移、侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，inhibitor組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與NC組比較，inhibitor組遷移、侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，見圖2(封3)、表1。

表1 Transwell試驗檢測下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲能力的影響個/HP)

注：與空白組比較，aP<0.05，與NC組比較，bP<0.05

注：A.NCM460、LoVo細胞株lncRNA RP11-110G21.1表達；B.細胞轉(zhuǎn)染后LoVo細胞lncRNA RP11-110G21.1表達；C.下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響；與NCM460亞組比較，aP<0.05；與空白組比較，bP<0.05；與NC組比較，cP<0.05

圖1 各組lncRNA RP11-110G21.1表達比較及下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響

2.4 不同臨床病理特征患者中l(wèi)ncRNA RP11-110G21.1表達的變化 以lncRNA RP11-110G21.1表達水平的平均值1.73為界分為高表達亞組76例和低表達亞組44例，結(jié)果顯示lncRNA RP11-110G21.1在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在分化程度低、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者中的高表達比例高于分化程度中高、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，見表2。

2.5 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA RP11-110G21.1表達與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier結(jié)果顯示，lncRNA RP11-110G21.1高表達亞組3年內(nèi)存活率(27.6%)低于低表達亞組(61.4%)(χ2= 13.212，P= 0.000)，見圖3。

圖3 結(jié)腸癌患者lncRNA RP11-110G21.1表達生存曲線分析

2.6 結(jié)腸癌患者預(yù)后危險因素分析 多因素Logistic回歸分析顯示，分化程度低、TNM分期高、lncRNA RP11-110G21.1高表達是影響結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討 論

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位。結(jié)腸癌發(fā)病與高脂肪和低纖維飲食有關(guān)，近年來隨飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，中期也僅有腹脹、消化不良等癥狀，待發(fā)生腹痛、黏液便時已為中晚期，且伴隨病灶轉(zhuǎn)移，貽誤最佳治療時期[7-12]，因此提高結(jié)腸癌早期診斷率、尋找新的分子治療靶標(biāo)及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)警指標(biāo)成為結(jié)腸癌研究中需解決的重大問題。結(jié)腸癌發(fā)生是多基因參與的過程，目前已發(fā)現(xiàn)多種促癌、抑癌基因參與結(jié)腸癌的癌變進程[13-17]。lncRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控型RNA，成為腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中表達異常。而本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA RP11-110G21.1表達顯著高于其癌旁組織，提示lncRNA RP11-110G21.1高表達與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且與分化程度、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)，此結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，表明lncRNA RP11-110G21.1異常高表達在結(jié)腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，同時也說明lncRNA RP11-110G21.1高表達縮短患者生存時間，不利于結(jié)腸癌患者預(yù)后，因此檢測lncRNA RP11-110G21.1水平可能對預(yù)測結(jié)腸癌的生物學(xué)行為與預(yù)后評估均具有一定參考價值。

表2 lncRNA RP11-110G21.1表達與結(jié)腸癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]

表3 結(jié)腸癌患者不良預(yù)后影響因素Logistic分析

本研究進一步通過在結(jié)腸癌細胞系LoVo中轉(zhuǎn)染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor使之表達下調(diào)，探討下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖影響，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后24 h細胞增殖緩慢且3組間差異不顯著，可能由細胞毒性影響轉(zhuǎn)染導(dǎo)致，48 h后inhibitor組吸光度(OD)值顯著低于空白組及NC組，同時發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達可使結(jié)腸癌細胞侵襲、遷移能力顯著降低。推測下調(diào)lncRNA RP11-110G21.1表達可抑制結(jié)腸癌癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，進一步說明lncRNA RP11-110G21.1可能通過影響結(jié)腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力影響結(jié)腸癌患者預(yù)后，但是由于本研究僅初步探討lncRNA RP11-110G21.1與結(jié)腸癌的關(guān)系，其內(nèi)在具體機制還有待進一步深入分析。

綜上所述，lncRNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌患者組織高表達，與患者臨床分期等病理特征有關(guān)，檢測其表達水平可能為預(yù)測患者腫瘤進展情況與評估預(yù)后提供參考；且降低lncRNA RP11-110G21.1表達可抑制結(jié)腸癌增殖、侵襲、遷移能力，可為提高結(jié)腸癌的診療效果提供新的研究思路。本研究存在一定不足之處，關(guān)于lncRNA RP11-110G21.1在結(jié)腸癌中的具體作用機制有待進一步研究。