基于CRISPR基因編輯系統(tǒng)抗番木瓜曲葉病毒的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

龍歡 趙輝 王緒朋 賈瑞宗 賀萍萍 孔華 郭運玲 郭安平

1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南?？??570228;2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？??571101;3. 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，海南?？??571101

摘 ?要??雙生科病毒具有毀滅性強、寄主多樣、分布地域廣等特點，一直是困擾世界農(nóng)作物生產(chǎn)的一大難題。用物理和化學(xué)方法防治該類病毒不僅花費成本高，見效低，而且還可能對環(huán)境造成負(fù)面影響，因此用分子手段培育抗病品種才是有效途徑之一。本研究結(jié)合最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和Golden Gate克隆技術(shù)，設(shè)計并構(gòu)建了抗番木瓜曲葉病毒基因編輯串聯(lián)多切點表達載體。表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1后經(jīng)注射本氏煙草葉片進行瞬時表達，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡能觀察到有綠色熒光的出現(xiàn)，定位的位置為細胞核與細胞質(zhì)膜。本研究為番木瓜抗曲葉病毒研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?基因編輯;曲葉病毒;番木瓜;瞬時表達中圖分類號??Q949.759.6??????文獻標(biāo)識碼??A

Construction of CRISPR Plant Expression Vectors Resistant to Papaya Leaf Curl Virus

LONG huan^1，2， ZHAO Hui^1，2*， WANG Xupeng²， JIA Ruizong^1，2， HE Pingping^1，2， KONG Hua^1，2，GUO Yunling^1，2， GUO Anping^1，2**

1. Institute of Tropical Agricultural and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan?570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan?571101， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The Geminivirus are characterized by strong destructiveness， diverse hosts， and wide geographical distribution. They have always been a major problem in the crop production of the world . The use of physical and chemical methods to control them is not only costly， but also has low efficacy， and may also have a negative impact on the environment. Therefore， it is one of the effective ways to cultivate disease-resistant varieties by?molecular breeding technology. The CRISPR/Cas9 gene editing technology and Golden Gate cloning technology were used to design and construct a gene editing multi-cut expression vector resistant to papaya leaf curl virus. The vector was transferred into Agrobacterium tumefaciens AGL1 and injected into the tobacco leaves for transient expression. After 48 h， the presence of green fluorescence was observed by a laser confocal microscopy. It was located in the nucleus and cytoplasmic membrane. The work would provide a theoretical basis for the study of papaya leaf curl virus.

Keywords ?genome editing; leaf curl virus; papaya; transient expression

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.015

番木瓜（Carica papayaL.）是熱帶地區(qū)最重要的消費和出口熱帶水果之一。目前從番木瓜上發(fā)現(xiàn)的病毒大多以番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）和番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus， PLDMV）為主，均為RNA病毒^[1]，近期，項目組從海南地區(qū)番木瓜葉片上分離出番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl virus， PaLCV），得病植株表現(xiàn)出植株矮小，葉柄卷曲，葉片皺縮失綠等現(xiàn)象，嚴(yán)重時植株絕產(chǎn)死亡。本研究利用最新的基因編輯手段，從病毒本身基因入手，力圖通過給番木瓜建立CRISPR免疫系統(tǒng)，來提高番木瓜對該類病毒的抗病性。

CRISPR基因編輯技術(shù)作為第3代基因編輯工具，是新型的分子育種技術(shù)，由于剪切位點的效率與剪切位點的堿基結(jié)合效率直接相關(guān)，與目標(biāo)基因功能無直接關(guān)系，該技術(shù)簡單易懂，適用性強，無論在植物基因編輯或是外抗外源病毒方面，都獲得廣泛關(guān)注和取得可喜的突破，在對抗雙生科曲葉病毒方面，前期可通過基因序列分析系統(tǒng)以及靶點評估系統(tǒng)篩選出在理論上能高效剪切DNA序列的sgRNA剪切位點，后期利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織的方法可以培育出抗曲葉病毒的陽性轉(zhuǎn)基因植物苗，在植物細胞內(nèi)可得到Cas9和sgRNA的穩(wěn)定表達，并形成sgRNA-Cas9的復(fù)合體。當(dāng)雙生科病毒感染植物時，病毒ssDNA會被釋放到植物細胞內(nèi)，隨后ssDNA會通過自身滾環(huán)復(fù)制形成無數(shù)個dsDNA拷貝。此時，sgRNA-Cas9復(fù)合體會自動識別病毒dsDNA的特定序列并對雙鏈DNA進行剪切，造成病毒DNA的雙鍵斷裂，斷裂后的序列會通過非同源性末端連接進行修復(fù)或造成病毒基因的降解^[2]。在目前所發(fā)表的研究成果中，中科院遺傳與發(fā)育研究所Ji等^[3]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)證明該系統(tǒng)可成功編輯甜菜嚴(yán)重曲頂病毒（Beet severe curly top virus， BSCTV），所選用的植株為本氏煙和擬南芥，首先利用瞬時表達體系篩選出高效的sgRNA切點，隨后在轉(zhuǎn)化水平上實現(xiàn)最終對甜菜嚴(yán)重曲頂病毒的抗性，從基因靶點的突變證據(jù)可說明該系統(tǒng)可以特異性切割目標(biāo)病毒DNA。明尼蘇達大學(xué)Baltes等^[4]用能表達熒光蛋白GFP的基因?qū)Σ硕裹S矮病毒序列進行改造，運用高通量測序、熒光強度分析等進行效率分析，無論是從瞬時表達水平還是從遺傳轉(zhuǎn)化層面，都能證明該系統(tǒng)能有效編輯病毒DNA，顯著降低病毒積累量。與此同時，阿卜杜拉國外科技大學(xué)Ali等^[5]也成功運用該系統(tǒng)實現(xiàn)對番茄黃化曲葉病毒進行高效編輯。以上研究都能有效阻止目標(biāo)病毒的積累復(fù)制，說明CRISPR系統(tǒng)在對抗雙生科DNA病毒方面具有可行性。

Golden Gate克隆技術(shù)是基于ⅡS酶識別序列位置和切割序列位置不一樣的特點，首先ⅡS型核酸內(nèi)切酶在識別DNA序列后會在識別位點之外切割DNA，然后產(chǎn)生黏性末端DNA片段，最后通過DNA連接酶可以將DNA片段按照特定的順序相連，連接好的片段不含使用過的ⅡS型核酸內(nèi)切酶識別位點^[6-9]，該方法簡單易懂，操作方便，通過該方法構(gòu)建載體只需一步法就可以完成構(gòu)建。為了達到廣譜高效的抗病效果，本研究結(jié)合CRISPR多切點載體技術(shù)、Golden Gate載體構(gòu)建技術(shù)、借鑒前人對抗雙生科曲葉病毒的研究^[2]，以及對該病毒海南株系的測序和生物信息學(xué)分析等，選擇了病毒DNA-A基因組基因間區(qū)IR、編碼外殼蛋白基因和移動蛋白基因共同區(qū)AV1/AV2，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白基因和AC4蛋白基因AC1/AC4，共3個病毒關(guān)鍵位點進行串聯(lián)的剪切設(shè)計，同時在植物表達載體的引導(dǎo)序列后引入一段熒光蛋白基因，通過熒光蛋白的瞬時表達，以驗證載體在煙草細胞的定位情況。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?菌株與載體??大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌AGL1化學(xué)感受態(tài)細胞購自北京天恩澤基因科技有限公司。載體pMOD_A0101、pMOD_B2301、pMOD_C3001、pTRANS_220d由美國明尼蘇達大學(xué)Dan Voytas實驗室合作提供。瞬時表達注射所用植株為室溫22?℃條件下生長1個月左右具有6～8片葉的健康野生型本氏煙草苗。

1.1.2??酶類及主要生化試劑??限制性核酸內(nèi)切酶LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;T4 DNA ligase購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;TaKaRa PrimerSTAR Max?DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid DNA Mini KitⅠ和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3??引物??如表1所示，根據(jù)海南番木瓜曲葉病毒DNA-A基因組IR區(qū)、AV1/AV2區(qū)和AC1/AC4區(qū)序列設(shè)計的sgRNA（小寫字母）和載體序列（大寫斜體字母），設(shè)計引物并加入LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ酶切位點（下劃線部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司廣州合成部合成。

1.2方法

1.2.1??sgRNA的設(shè)計??根據(jù)本實驗室從番木瓜葉片上所分離的曲葉病毒DNA全長，將其序列導(dǎo)入網(wǎng)站Tefor（http：//crispor.tefor.net/），分析可行的sgRNA和其脫靶效益，然后將理想的sgRNA序列信息導(dǎo)入網(wǎng)站Phytozome（https：//phytozome.?jgi.doe.gov/pz/portal.html）與番木瓜基因組進行Blast分析，最后將理想的sgRNA序列信息導(dǎo)入網(wǎng)站W(wǎng)ebtools for the Voytas Lab Plant Genome Engineering Toolkit（http：//cfans-pmorrell.oit.umn.?edu/CRISPR_Multiplex/assembly.php），最終確定3個sgRNA序列信息如表1所示。

1.2.2 ?pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化??參考王緒朋等^[10]的載體構(gòu)建方法，對終載體進行構(gòu)建。第1步，通過PCR克隆出目的片段，PCR反應(yīng)可分為4個Reaction反應(yīng)，電泳后對目的片段進行膠回收。第2步，中間載體的構(gòu)建。將第1步的膠回收產(chǎn)物與模板pMOD_B2301質(zhì)粒進行第1個Golden Gate克隆反應(yīng)，完成后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板培養(yǎng)，挑選正確的陽性單克隆送去測序，選擇與理論序列一致的陽性單克隆進行培養(yǎng)，提取中間載體質(zhì)粒。第3步，pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-?Cas9-mgfp6終載體的構(gòu)建。將第2步所提取的中間載體質(zhì)粒與模板pMOD_A0101、pMOD_C3001和pTRANS_220d進行第3個Golden Gate克隆反應(yīng)，完成后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板培養(yǎng)，挑選正確的陽性單克隆送去測序，選擇與理論結(jié)果一致的陽性單克隆進行培養(yǎng)，提取終載體質(zhì)粒。終載體質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ與Hind?Ⅲ酶切驗證無誤后轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1，菌液經(jīng)PCR檢測后，挑選出正確的陽性單克隆菌液備用。

1.2.3 ?瞬時表達與熒光觀察??參考王緒朋等^[10]的載體瞬時表達重懸液配方，將含有pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6終載體的農(nóng)桿菌AGL1菌液進行培養(yǎng)至對數(shù)生長期后離心并重懸，重懸液重懸后控制OD₆₀₀在1.0～1.2之間，放置室溫3 h左右，用1 mL去針頭的注射管吸取活化好的菌液并注射生長時間為1個月左右的本氏煙草葉片背部，挑選中上部的葉片為最佳，每株重復(fù)注射葉片3片，共注射3株。將注射好的煙草苗放至培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)，保持室溫22?℃，同時為了排除野生型煙草葉片本身的熒光干擾，設(shè)置了不做任何處理注射的對照組，對照組與處理組其余條件均一致。熒光觀察參考Li等^[11]的亞細胞定位方法，在注射含pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-?Cas9-mgfp6終載體的AGL1菌液48 h后，將注射后的煙草葉片接種部位全部剪下，裁剪成約2 cm²的圓形，將其制成簡易切片，操作OLYMPUS FLUOVIEW激光共聚焦熒光顯微鏡FV1000進行觀察，設(shè)置激發(fā)波長為488 nm。

2??結(jié)果與分析

2.1PCR擴增目的片段與中間載體驗證

PCR Reaction 1所需引物對為O35S和OtRNAB_IR，理論大小654 bp;PCR Reaction 2所需引物對為OrepC_IR和OtRNAB_R/C，PCR Reaction 3所需引物對為OrepC_R/C和OtRNAB_C/M，理論大小均為193 bp;PCR Reaction 4所需引物對為OrepC_C/M和OtRNAE，理論大小為181 bp。共有4管PCR反應(yīng)產(chǎn)物，實際擴增情況如圖1所示，對紅色箭頭所示的目的條帶進行膠回收。在第一個Golden Gate反應(yīng)結(jié)束后，含中間載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物將會轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑菌并培養(yǎng)，菌液PCR用引物對TC089R/ZY010F檢測，挑選與目的條帶相符的3～5個陽性單克隆送至公司測序，測序信息返回后比對，選擇與理論序列相符合的菌液進行培養(yǎng)。

2.2表達載體酶切、PCR及測序驗證

在第二個Golden Gate克隆反應(yīng)結(jié)束后，含終載體質(zhì)粒的反應(yīng)產(chǎn)物會轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑菌并培養(yǎng)，菌液PCR用引物對TC430/M13F檢測，挑選與目的條帶相符的3～5個陽性單克隆送至公司測序，測序信息返回后選擇與理論序列相符合的菌液進行培養(yǎng)，隨后提取質(zhì)粒，將構(gòu)建好的終載體pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6質(zhì)粒進行酶切驗證，挑選在終載體上分別只有一個切點位置的限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和限制性核酸內(nèi)切酶Hind?Ⅲ。終載體總長度為17345?bp，當(dāng)EcoRⅠ與Hind?Ⅲ同時酶切時，可以同時切出兩條目的條帶，大小為5088 bp和12257 bp，如圖2和圖3所示。

2.3瞬時表達熒光結(jié)果

煙草葉片注射48 h后，在488 nm藍光的激發(fā)下，觀察到由綠色熒光蛋白產(chǎn)生的509 nm的綠色熒光，如圖4所示。處理組葉肉細胞發(fā)出熒光的部位為葉肉細胞核與細胞質(zhì)膜部分，而在對照組Control中并未觀察到綠色熒光的發(fā)生。由于CRISPR/Cas9基因編輯載體AtCas9、sgRNA和mgfp6基因的表達由植物35S啟動子所啟動，瞬時表達的結(jié)果說明該載體能在植物體內(nèi)進行表達，可進行下一步轉(zhuǎn)化工作。

M：DNA Marker?Ⅲ;1～4分別是PCR Reaction 1–4的擴增產(chǎn)物。

M： DNA Marker?Ⅲ; 1–4： Amplification productsof PCR Reaction 1–4.

終載體Cas9酶源自于pMOD_A0101，sgRNA部分源自于中間載體pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA，mgfp6部分源自于pMOD_C3001。

The Cas9 construct from pMOD_A0101，?the sgRNA construct from pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA，?the mgfp6 construct from pMOD_C3001.

本氏煙草葉片GFP熒光觀察（標(biāo)尺為20 ?m）。

3??討論

在CRISPR技術(shù)未應(yīng)用到雙生科病毒防治之前，在對抗雙生科病毒方面應(yīng)用最廣泛的是利用病毒基因片段誘導(dǎo)的抗性育種，向植物細胞轉(zhuǎn)入病毒外殼蛋白、復(fù)制酶、運動蛋白等克隆基因來實現(xiàn)抗性。Kunik等^[12]用番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，接種病毒后能表現(xiàn)出病毒抗性，但由于CP蛋白對于單組分的雙生科病毒是必須的^[13]，對于雙組分的雙生科病毒卻不是必須的^[14]。所以用利用病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性具有很大的局限性，后續(xù)研究用轉(zhuǎn)病毒Rep、突變體REn等策略來獲得病毒抗性^[15-16]，但都存在一定的局限性。隨著TALE與RNAi技術(shù)的發(fā)展，陳方圓^[17]成功運用TALE技術(shù)對抗番茄黃化曲葉病毒和甘藍曲葉病毒，通過凝膠阻滯實驗與South雜交印記分析發(fā)現(xiàn)人工TALE蛋白可以特異性結(jié)合病毒并且降低病毒DNA積累量。Zrachya等^[18]根據(jù)病毒CP蛋白構(gòu)建了siRNAs，實現(xiàn)了對番茄黃化曲葉病毒的抗性。Chellappan等^[19]用siRNA成功對抗非洲木薯花葉病毒。與其他基因育種技術(shù)相比，CRISPR系統(tǒng)操作更為簡單，不需要很繁瑣的載體構(gòu)建過程，同時利用CRISPR系統(tǒng)來進行剪切DNA病毒目的直接明確，剪切效率取決于sgRNA與模板的結(jié)合效率，剪切效率與基因功能無直接關(guān)系，故減少脫靶效率才是運用該技術(shù)的重中之重。在目前關(guān)于基因編輯轉(zhuǎn)基因植物抗雙生科病毒的抗性研究中，2019年4月瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工大學(xué)植物研究所于Genome Biology上發(fā)表文章，在本研究中，研究小組證明轉(zhuǎn)化基因編輯單切點載體的轉(zhuǎn)基因植物和對照組植物在對抗非洲木薯花葉病毒的抗性水平上差異不顯著，并預(yù)測了基因編輯多切點載體在對抗植物病毒方面的有效性，同時發(fā)現(xiàn)運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對抗病毒可導(dǎo)致一種新的保守突變病毒的出現(xiàn)，基因突變導(dǎo)致進化出了一種新的病毒，該病毒不能被原始sgRNA-Cas9復(fù)合體所識別，從而避免了被宿主植物中CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割^[20]，不過該研究并未通過轉(zhuǎn)化基因編輯多切點載體來獲得抗性植株并進行后續(xù)抗病試驗。

本研究的試驗策略基于基因編輯多切點對抗病毒的可行性，運用了Golden Gate一步克隆法構(gòu)建了可以同時串聯(lián)3個切點序列的抗曲葉病毒基因編輯多切點表達載體pCRISPR-PaLCV-3sgRNA?-Cas9-mgfp6，此方法構(gòu)建載體簡單，耗時短，包括前期靶點設(shè)計，基本上15 d左右便能完成載體構(gòu)建工作。在前期設(shè)計靶點時，既要考慮脫靶效率，sgRNA-Cas9復(fù)合體在對病毒DNA雙鏈發(fā)生剪切時，是否理論上也會對植物基因組發(fā)生剪切的情況，又要考慮靶點的高效性與廣譜性。同時，在設(shè)計多切點時，應(yīng)保證各切點中間4個bp堿基序列至少有一個不同，否則會在構(gòu)建Mould B板塊時出現(xiàn)各切點PCR產(chǎn)物無法連接或者連接錯誤的情況發(fā)生。根據(jù)剪切核酸類型的不同，可以挑選不同種類的Cas核酸酶。本研究中所構(gòu)建的終載體在sgRNA后插入一段由35S啟動子引導(dǎo)的mgfp6報告基因，由于該報告基因本身不會發(fā)光，只有在轉(zhuǎn)入植物細胞后通過35S啟動子所啟動后，才能轉(zhuǎn)錄并翻譯成熒光蛋白，該蛋白可以被488 nm藍光激發(fā)，后期通過激光共聚焦顯微鏡可以觀察到熒光部位，該報告基因的插入可以通過瞬時表達觀測熒光情況來判斷載體是否構(gòu)建成功以及在植物細胞內(nèi)的表達情況，由于轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)會表達GFP蛋白，故選用GFP作為報告基因的缺點在于轉(zhuǎn)基因植物只能局限于實驗研究。本研究還需繼續(xù)探討的方面包括后期轉(zhuǎn)基因作物能否穩(wěn)定表達Cas9蛋白、后期轉(zhuǎn)基因作物的抗病性以及脫靶效率，最終確定有抗病能力的番木瓜轉(zhuǎn)化株需繼續(xù)進行田間抗病試驗，從而達到真正的抗病效果。

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