甘蔗花粉離體萌發(fā)研究

常海龍 張偉 陳俊呂 郭育強 方娜 邱永生 周峰 吳建濤 劉壯 劉少謀 王勤南

摘 ?要??為篩選適宜栽培種甘蔗花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基配方，建立有效的離體萌發(fā)體系，以糖用甘蔗主栽品種ROC22花粉為材料，通過單因素試驗探索滿足甘蔗花粉離體萌發(fā)的基本條件，然后利用L₁₆（4⁵）正交試驗，尋求甘蔗花粉離體萌發(fā)的最適宜培養(yǎng)基配方，在此基礎上進一步探討不同溫度對甘蔗花粉萌發(fā)的影響。在單因素試驗中，培養(yǎng)基以剛好凝固時為最佳。蔗糖、硼酸和硝酸鈣在一定范圍內對甘蔗花粉萌發(fā)起促進作用，超過一定濃度則起抑制作用。硫酸鎂作用不穩(wěn)定，硝酸鉀影響較小。正交試驗中，蔗糖對甘蔗花粉離體萌發(fā)率和花粉管生長速率影響最大，呈顯著水平，硼酸次之，硫酸鎂影響最小?；ǚ勖劝l(fā)的適宜溫度為30 ℃，萌發(fā)率和花粉管長度分別為89.83%和143.03 μm。200 g/L蔗糖+400 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣+400 mg/L硫酸鎂+1 g/L瓊脂，在30 ℃下培養(yǎng)花粉萌發(fā)率最高，花粉管生長狀態(tài)良好，這種方法可快速有效鑒定不同甘蔗花粉活力差異。

關鍵詞 ?栽培種;甘蔗花粉;離體萌發(fā);正交設計中圖分類號??S566.1??????文獻標識碼??A

Sugarcane Pollen Germination in vitro

CHANG Hailong， ZHANG Wei， CHEN Junlyu， GUO Yuqiang， FANG Na， QIU Yongsheng， ZHOU Feng， WU Jiantao， LIU Zhuang， LIU Shaomou， WANG Qinnan^*

Hainan Sugarcane Breeding Station，?Guangzhou Sugarcane and Sugar Industry Institute?/ Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station，?Ministry of Agriculture?& Rural Affairs， Sanya， Hainan 572025， China

Abstract ?The pollens of sugarcane?cultivar ROC22 were used as the main experimental material to seek for the basic conditions of the pollen germinationin vitroby a?single factor experiment， and the most appropriate culture medium formula was explored by an orthogonal experiment L₁₆（4⁵）?in order to investigate the effects on sugarcane pollen germination under different temperatures. In the single factor experiment， the culture medium solidified slightly had?the best effect. In certain range of concentration， sucrose， boric acid and calcium nitrate might promote pollen germination?and inhibit pollen germination over the critical concentration. In addition， magnesium sulfate worked unsteadily， and the effect of potassium nitrate was little. In the orthogonal experiment， sucrose influenced significantly on the pollen germination ratein vitroand the pollen tube growth rate， boric acid took the second place， magnesium sulfate had little effect. The optimum temperature for pollen germination was 30?℃， the pollen germination rate was 89.93% and the pollen tube length was 143.03 μm. It is concluded that， under 30?℃， the pollen had the highest germination rate and the pollen tube grew well using the best culture medium formulas?（200 g/L sucrose， 400 mg/L boric acid， 100 mg/L calcium nitrate， 400 mg/L magnesium sulfate and 1 g/L agar），?which?might help to identify the difference of various sugarcane pollen efficiently.

Keywords ?cultivar; sugarcane pollen; germinationin vitro; orthogonal design

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.022

自18世紀末Sotwedel和Harrison發(fā)現(xiàn)甘蔗在自然環(huán)境下開花結實以來，有性雜交一直是培育甘蔗新品種的主要途徑^[1]。但甘蔗花粉發(fā)育受外界環(huán)境影響，每年不同親本間花粉活性差異較大，所配雜交組合中約25%的花穗結實率接近于零，這不但浪費勞動力，且不利于甘蔗雜交育種技術的持續(xù)發(fā)展?？梢?，甘蔗花粉的活性鑒定是雜交種質量與純度的重要指標^[2]。因此，為了提高甘蔗雜交結實率，配制親本花粉活性強的優(yōu)勢組合，也為衡量甘蔗各品種（系）遺傳雄性不育系不育程度及為甘蔗人工雜交授粉提供理論指導，有必要對其花粉生活力進行檢測。花粉離體萌發(fā)因其數據可靠并完全定量而成為目前雜交育種中花粉生活力測定的首選方法^[3]。

瓊脂、蔗糖、硼酸、Ca²⁺、Mg²⁺和K⁺作為花粉離體培養(yǎng)的基本組成成分在蔗茅^[4]、果梅^[5]、小麥^[6]、月季^[7]等很多植物中均有應用，但不同植物花粉培養(yǎng)條件有一定的差異。甘蔗花粉屬于典型的三核型花粉，外壁薄，對干燥敏感，其花粉生活力丟失速率是二核型花粉的2倍，離體后往往很快失去活力^[8]，長期以來甘蔗花粉的離體萌發(fā)沒有得到很好地解決。本文以甘蔗花粉為材料，在前期單因素試驗基礎上，采用正交設計研究花粉離體萌發(fā)的最適宜培養(yǎng)基成分，并研究了溫度對甘蔗花粉萌發(fā)的影響，以期篩選出甘蔗花粉離體萌發(fā)的最適宜培養(yǎng)體系，為甘蔗花粉活力測定提供一個高效、快速、簡便的方法。

1??材料與方法

1.1材料

本研究以海南甘蔗育種場ROC22為試驗材料。2017年11月上旬花穗盛開期開始，提前1?d于傍晚時分把接近盛開的試材從莖中下部剪斷，溫室條件下于清水缸中培養(yǎng)。翌日清晨7點開始觀察螽花開放時間，收集花粉，去除雜質裝入密封塑料管中待用。

1.2方法

1.2.1 ?單因素試驗??參照李富生等^[4]關于蔗茅花粉的培養(yǎng)方法。分別對培養(yǎng)基組分中瓊脂、蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硫酸鎂及硝酸鉀進行單因素試驗（表1）;除蔗糖因子外，其他因子的試驗均在150?g/L的蔗糖濃度下進行。

1.2.2??正交試驗??在單因素試驗的基礎上，為探討甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管生長的最佳培養(yǎng)基配方，采用L₁₆ （4⁵）正交設計，研究培養(yǎng)基組分中蔗糖（A）、硼酸（B）、硝酸鈣（C）硫酸鎂（D）4個因素的各個水平對甘蔗花粉離體萌發(fā)的影響，因素水平安排見表2。

1.2.3 ?不同溫度對甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響??在篩選出最適蔗糖、硼酸、硝酸鈣和硫酸鎂濃度的基礎上，利用最優(yōu)培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為26、28、30、32 ℃下篩選出甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管生長的適宜溫度。

1.2.4??萌發(fā)率和花粉管長度的測定??花粉萌發(fā)以花粉管長度超過花粉直徑為標準，在光學顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)及未萌發(fā)情況，并統(tǒng)計萌發(fā)率（同一視野中萌發(fā)的花粉占花粉總數的百分比）。每個玻片取3個視野統(tǒng)計萌發(fā)率，每個視野的花粉數不少于100個，每個處理統(tǒng)計3個玻片。

測定花粉萌發(fā)率的同時，選取已萌發(fā)的花粉，利用攝像系統(tǒng)截取圖片，用Image-Prous?6.0圖像分析軟件測定花粉管長度，每個處理選取6個視野統(tǒng)計截圖內所有萌發(fā)花粉管長度。

1.3數據處理

數據采用Excel軟件繪制圖表及SPSS13.0軟件進行方差分析及多重比較。

2??結果與分析

2.16個單因素對甘蔗花粉萌發(fā)的影響

通過對瓊脂、蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硫酸鎂和硝酸鉀的單因素試驗結果表明，6個單因素對甘蔗花粉萌發(fā)都有一定影響，不同因素水平間變化不相同（圖1）。瓊脂對花粉萌發(fā)作用顯著，呈現(xiàn)“倒V”型變化趨勢，含量為0時花粉無萌發(fā)，1 g/L即培養(yǎng)基剛好凝固時花粉萌發(fā)率達最高值，之后隨著瓊脂質量濃度增加，萌發(fā)率急速降低，4?g/L時回落到無萌發(fā)狀態(tài)。蔗糖質量濃度為0時，花粉無萌發(fā)，隨著蔗糖質量濃度的增加花粉萌發(fā)率呈“拋物線”趨勢增長，150 g/L時花粉萌發(fā)率增長趨勢放緩，與200?g/L時花粉萌發(fā)率相比僅相差0.43%。推測，花粉萌發(fā)適宜蔗糖質量濃度在200?g/L左右。硼酸質量濃度為100～200?mg/L時花粉萌發(fā)率增長幅度較高，300?mg/L時花粉萌發(fā)率達最高值。硝酸鈣質量濃度在0～300 mg/L時花粉萌發(fā)率呈指數增長趨勢，之后緩慢降低。隨著硫酸鎂質量濃度增加花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)“扁平M”態(tài)勢，在100、300?mg/L時花粉萌發(fā)率較高，0、400?mg/L時花粉萌發(fā)率處于較低水平。硝酸鉀對花粉萌發(fā)率影響較小，隨著硝酸鉀質量濃度增加花粉萌發(fā)率變化幅度較低，100 mg/L時花粉萌發(fā)率最高為10.85%，最低值為300 mg/L時的9.15%，兩者相差僅1.70%。綜上所述，甘蔗花粉萌發(fā)的適宜條件為：200 g/L蔗糖，300 mg/L硼酸，300～400 mg/L硝酸鈣，100～300 mg/L硫酸鎂，1?g/L瓊脂，硝酸鉀對花粉萌發(fā)影響極小，可忽略不計。

2.24因素正交試驗對甘蔗花粉離體萌發(fā)的影響

在單因素試驗基礎上，為尋求蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硫酸鎂的最佳組合，將新鮮甘蔗花粉接種在利用L₁₆ （4⁵）正交設計的培養(yǎng)基中（表3）。從表3可知，不同培養(yǎng)基上甘蔗花粉的萌發(fā)率不同。其中，組合10（A₃B₂C₄D₃）上的萌發(fā)率最高為85.52%，與最低組合1（A₁B₁C₁D₁）相差高達55.24%;組合12（A₃B₄C₂D₁）上的花粉管長度最高為112.27 μm，顯著高于其他組合，且花粉管長度適宜，分布均勻。對表3的數據進行直觀分析和方差分析，結果見表4和表5。

各因素內水平極差（R）的大小反映該因素對試驗結果的影響程度，極差越大表明影響越大。由表4直觀極差分析可知，參試的4個因素對花粉萌發(fā)率影響的主次關系依次：為A（蔗糖）>B（硼酸）>C（硝酸鈣）>D（硫酸鎂），蔗糖對花粉的萌發(fā)影響最大，硼酸次之，而硫酸鎂影響最小。以甘蔗花粉的花粉管長度為衡量指標，各因素的極差大小順序為A（蔗糖）>（B）硼酸>D（硫酸鎂）>C（硝酸鈣）。蔗糖對花粉管長度影響最大，硼酸次之，硝酸鈣影響最小。由極差分析可知，蔗糖與硼酸濃度對甘蔗花粉萌發(fā)及花粉管生長最為關鍵。

由直觀分析圖2可知，花粉萌發(fā)率與花粉管長度都隨著蔗糖濃度的升高出現(xiàn)先增加后降低的趨勢;硼酸濃度升高花粉萌發(fā)率也出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。相反，花粉管長度是先降低后增加;硝酸鈣濃度對花粉萌發(fā)率及花粉管長度影響不大，硫酸鎂濃度僅對花粉管長度有影響，出現(xiàn)先降低后升高的趨勢。由直觀分析圖可知適宜花粉萌發(fā)的最優(yōu)組合為A₃B₂C₁D₄，即蔗糖200 g/L、硼酸400?mg/L、硝酸鈣100?mg/L、硫酸鎂400?mg/L。適宜花粉管生長的最優(yōu)組合為A₃B₂C₁D₂，即蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸鈣100 mg/L、硫酸鎂200 mg/L。對最優(yōu)組合

A₃B₂C₁D₄和A₃B₂C₁D₂進行花粉離體萌發(fā)驗證（圖3），經統(tǒng)計分析確認2組合萌發(fā)率差異顯著，花粉管長度差異不顯著，且經A₃B₂C₁D₄培養(yǎng)的花粉管長度長短適宜，分布均勻。因此，從花粉萌發(fā)率和花粉管長度2方面綜合考慮最優(yōu)組合為A₃B₂C₁D₄。綜上所述，甘蔗花粉離體萌發(fā)的適宜條件為蔗糖200?g/L、硼酸400?mg/L、硝酸鈣100?mg/L、硫酸鎂400 mg/L。

由表5方差分析可見，蔗糖和硼酸對甘蔗花粉萌發(fā)率均達到顯著或極顯著影響，是甘蔗花粉萌發(fā)最關鍵因素，其他因素影響不顯著;誤差偏差平方和94.73遠小于分析的蔗糖和硼酸偏差平方和，但大于硝酸鈣和磷酸鎂，推測甘蔗花粉離體萌發(fā)除了以上分析的4因素外，還存在其他一些影響因素，比如取材時間、操作技術及培養(yǎng)環(huán)境等。4因素中蔗糖對甘蔗花粉管伸長影響達到顯著水平，其他因素不顯著;但誤差偏差平方和391.97遠大于硼酸的272.70和硝酸鈣的72.22，說明在影響花粉管伸長方面除了以上分析的4因素外還有其他因素對花粉管伸長起到重要影響，有待進一步分析。

2.3同溫度對甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

花粉萌發(fā)是花粉細胞內一系列生化反應的結果，而適宜的溫度是生化反應正常進行的基本條件之一。將甘蔗新鮮花粉接種在最優(yōu)組合A₃B₂C₁D₄的培養(yǎng)基上，分別放置在26、28、30、32?℃的培養(yǎng)箱中，2?h后統(tǒng)計萌發(fā)率和花粉管長度。由表6分析結果可知，不同培養(yǎng)溫度對甘蔗花粉萌發(fā)率和花粉管長度都具有顯著的影響?；ǚ勖劝l(fā)率和花粉管長度隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加，當溫度為30?℃花粉萌發(fā)率和花粉管長度都達到最高，為89.83%和143.03?μm極顯著高于其他培養(yǎng)溫度。溫度為28、32?℃時花粉萌發(fā)率和花粉管長度差異不顯著，但顯著高于培養(yǎng)溫度為26?℃的萌發(fā)率。綜上分析可知，甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管正常生長的適宜溫度為30?℃，溫度過高或過低均不利于甘蔗花粉的萌發(fā)。

3??討論

3.1養(yǎng)基組分對甘蔗花粉萌發(fā)的影響

瓊脂主要起到固化培養(yǎng)基的作用，不同植物花粉萌發(fā)所需瓊脂濃度各有差異。王開良等^[9]研究認為，余甘子花粉萌發(fā)適宜的瓊脂濃度為20g/L;杜紀紅等^[10]認為桃花花粉萌發(fā)適宜濃度為10 g/L。本研究結果表明1 g/L的瓊脂濃度對花粉萌發(fā)效果最好，低于1?g/L時培養(yǎng)基無法固化成型，花粉凹進培養(yǎng)基內部，萌發(fā)率降低且花粉管彎曲變形不易于統(tǒng)計比較。高于1?g/L時培養(yǎng)基硬度逐漸增大，花粉散落在培養(yǎng)基表面，透氣性較好，但不利于花粉吸收營養(yǎng)成分，萌發(fā)率逐漸降低且花粉管較細，不健壯。

蔗糖對花粉的萌發(fā)和花粉管的生長具有明顯的促進作用，一是花粉粒萌發(fā)及花粉管壁合成的主要營養(yǎng)物質，又是參與花粉代謝與跨膜運輸的碳源^[11];二是維持外界環(huán)境一定的滲透壓^[12]。濃度過低，花粉吸水，花粉壁破裂;濃度過高，花粉失水，導致花粉質壁分離抑制花粉萌發(fā)^[13]。因此，蔗糖濃度必須控制在合理的范圍之內。不同植物花粉所需濃度各有差異，應與品種遺傳特性不同或花粉滲透壓不同有關。羅鳳霞等^[14]研究表明，不同品種水仙花粉萌發(fā)所需的蔗糖濃度不一樣，當蔗糖濃度為100～150 g/L時具有較高的萌發(fā)率;趙麗娟等^[15]研究表明，小黑楊花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為150 g/L。本研究結果表明，蔗糖對甘蔗花粉萌發(fā)有極顯著影響，在100～200 g/L時，隨著蔗糖濃度增加，花粉萌發(fā)率及花粉管長度逐漸提高，當蔗糖濃度為200 g/L時，花粉管長度均勻、生長健壯、直立不彎曲，其萌發(fā)率也達到最高值，硼在植物體內含量很低，且分布不均勻，以花中含量最高，花中又以柱頭和子房最多，硼離子與糖結合能夠形成絡合物，使糖易于通過質膜在組織中運輸，增加氧的吸收，從而促進糖的吸收與代謝^[16];硼還能參與果膠物質的合成，有利于花粉管壁的形成，因而有利于花粉管生長。不同植物種類的花粉萌發(fā)和生長所需的最適硼酸濃度不同，如紫丁香的最適濃度為600?mg/L^[17]、麻瘋樹適宜的硼酸濃度為100?mg/L^[18]。本研究結果表明，硼酸是甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管伸長所必須的一種營養(yǎng)物質，對花粉的萌發(fā)有顯著促進作用，甘蔗花粉萌發(fā)及花粉管伸長適宜的濃度為400 mg/L。

研究表明，Ca²⁺的動態(tài)變化對啟動花粉萌發(fā)、調節(jié)花粉管伸長等環(huán)節(jié)具有重要作用^[19-21]，花粉離體萌發(fā)時需要適當的外源Ca²⁺，缺鈣或濃度過高都會導致花粉萌發(fā)和花粉管生長受阻^[22-23]。在本研究中，硝酸鈣的單因子和正交試驗結果均表明，低濃度的硝酸鈣對甘蔗花粉萌發(fā)有一定的促進作用，對花粉管長度的生長影響較小。甘蔗花粉離體萌發(fā)適宜的硝酸鈣質量濃度為100 mg/L，硝酸鈣質量濃度增加時抑制甘蔗花粉萌發(fā)和花粉管的生長，可見甘蔗花粉本身含有一定量的Ca²⁺，當花粉吸水時，表面鈣離子釋放到培養(yǎng)基中啟動花粉萌發(fā)^[24-25]。

3.2溫度對甘蔗花粉萌發(fā)的影響

作為熱帶作物，甘蔗抽穗開花受溫度影響較大，溫度過高或過低都不利于花粉萌發(fā)。周峰等^[26]研究認為夜間溫度控制在25?℃，10 h可明顯促進甘蔗花芽分化;王麗萍等^[27]通過對甘蔗光周期誘導處理后發(fā)現(xiàn)，孕穗期適宜提高溫度可顯著增加花粉量及花粉育性。本試驗結果表明，甘蔗花粉萌發(fā)率和花粉管發(fā)育對溫度十分敏感，26～28?℃條件下花粉萌發(fā)率較低，花粉管生長緩慢;28～30?℃條件下花粉萌發(fā)率逐漸增加，花粉管生長速度也較快;30～32?℃條件下花粉萌發(fā)率逐漸降低，花粉管易彎曲打折影響統(tǒng)計分析，最適宜培養(yǎng)溫度為30?℃，花粉萌發(fā)率和花粉管長度最高，極顯著高于其他培養(yǎng)溫度，且花粉管直立，生長健壯，易于花粉生活力的比較分析。

綜上所述，栽培種甘蔗花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)方式為：培養(yǎng)基（蔗糖200 g/L+硼酸400 mg/L+硝酸鈣100?mg/L+硫酸鎂400 mg/L+瓊脂1 g/L），置于30?℃恒溫培養(yǎng)箱內濕潤環(huán)境下培養(yǎng)效果最佳，可快速、準確鑒定甘蔗花粉活力。

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