籽用大麻性別連鎖標(biāo)記的驗(yàn)證及SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)

趙銘森 方書(shū)生 陳瑤 康紅梅 高金虎 陳思遠(yuǎn) 楊昕 馮旭平 張立武

摘 ?要??大麻是雌雄異株的異花授粉作物，在苗期鑒定出植株的性別，對(duì)大麻育種及生產(chǎn)具有重要的意義。為開(kāi)發(fā)與籽用大麻品種性別連鎖的SCAR標(biāo)記，本研究以汾麻3號(hào)、榆社麻和蒼山麻為試驗(yàn)材料，研究已有的11個(gè)性別連鎖標(biāo)記在籽用大麻品種中的適用性。結(jié)果表明，3個(gè)標(biāo)記（OPD-05、UBC-354和MADC2）在籽用大麻品種中呈雄性特異，尚未發(fā)現(xiàn)雌性特異條帶?；厥招坌蕴禺悧l帶并測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果新開(kāi)發(fā)了6個(gè)SCAR標(biāo)記，其中MADC2-8表現(xiàn)最好;進(jìn)而利用123份已知性別的樣本來(lái)檢測(cè)MADC2-8的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)其平均準(zhǔn)確性高達(dá)98.34%。該研究不僅豐富了大麻性別鑒定的分子標(biāo)記，而且為大麻性別研究和實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?大麻;籽用品種;性染色體;SCAR;MADC中圖分類號(hào)??S563.3??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Evaluation of Markers Linked to Sex-specific and Development of SCAR Makers in Seed Hemp （Cannabis sativa?L.）

ZHAO Mingsen^1，2， FANG Shusheng^2，3*， CHEN Yao^2，3， KANG Hongmei¹， GAO Jinhu¹， CHEN Siyuan^2，3， YANG Xin^2，3， FENG Xuping¹， ZHANG Liwu^2，3**

1.?Institute of Economic?Crops， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi?030000， China; 2. Key Laboratory for Genetics， Breeding and Multiple Utilization of Crops，?Ministry of Education / Fujian Key Laboratory for Crop Breeding by Design， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China; 3.?Experiment Station of Jute and Kenaf in Southeast China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Public Platform for Germplasm Resources of Bast Fiber Crops of Fujian， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China

Abstract ?Hemp?（Cannabis sativa L.） is a dioecious and cross pollinated plant. Sex identification of plants at seedling stage is of great significance for breeding and production in hemp. To develop new SCAR markers linked to sex-specific， three Chinese local seed hemp varieties， Fenma No.3， Yushema and Cangshanma， were used as the experimental materials to investigate the application of 11 markers linked to sex-specific in Chinese local seed hemp varieties in this study. The results showed that three makers （OPD-05 and UBC-354 as well as MADC2） were male-specific， while no female specific bands were found. Novel SCAR markers were developed on the basis of sequences of male specific bands. Among them， MADC2-8 was the best. Furthermore， 123 samples with known sex identification were used to assess the accuracy of MADC2-8. The average accuracy was 98.34%. These results?would?not only enrich the molecular markers linked to sex-specific， but also lay a foundation for the research and practical application of sex identification in hemp.

Keywords ?Cannabis sativa; seed variety; sex chromosome; SCAR; MADC

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.023

大麻（Cannabis sativaL.）為大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（CannabisL.），屬短日照異花授粉作物，雌雄異株^[1]。按栽培目的進(jìn)行分類，大麻可分為纖用型（工業(yè)大麻）、籽用型（油用型）、藥用型等。籽用型品種籽產(chǎn)量高，含油可達(dá)32%以上;纖用型品種麻皮產(chǎn)量高，出麻率高，纖維柔軟、色白、有光澤;藥用型品種花葉產(chǎn)量高，大麻二酚含量高^[1-4]。大麻植株有雌株及雄株不同類型，不同性別的植株形態(tài)存在較大差異。大麻從種子萌發(fā)到開(kāi)花一般需要3個(gè)月以上的時(shí)間，在此之前不能從形態(tài)上準(zhǔn)確判斷植株性別^[5]，只有在開(kāi)花時(shí)才能從形態(tài)上準(zhǔn)確判斷植株性別，生產(chǎn)上通常采用多留苗，到時(shí)雄性植株開(kāi)花后自然死亡，這樣造成極大的浪費(fèi)。因此，在苗期鑒定出植株的性別，對(duì)大麻育種及栽培均具有重要的意義。利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠克服形態(tài)和生理生化指標(biāo)受環(huán)境及發(fā)育階段影響的缺點(diǎn)，從分子水平上在苗期鑒定出植株的性別。

關(guān)于大麻性別，前人早在20世紀(jì)初就展開(kāi)了研究。Hirata等^[6]發(fā)現(xiàn)大麻是有2個(gè)異型性染色體的雌雄異型植株，Yamada等^[7]指出大麻雌株有2個(gè)X染色體，雄株有1個(gè)X染色體和1個(gè)Y染色體。Warmke等^[8]研究表明，常染色體并不參與大麻性別表達(dá)，其性別表達(dá)差異與X、Y染色體上分別攜帶雌性和雄性表達(dá)的基因有關(guān)。大麻的核型是由9對(duì)常染色體和1對(duì)性染色體（X和Y）^[9-10]，其性別表達(dá)是由Y染色體控制^[11-12]。而同大麻親緣關(guān)系最近的啤酒花（Humulus lupulus）性別卻受X染色體與常染色體比值影響^?[13-14]。在其他物種中如黃瓜，其性別性狀可以由一個(gè)大片段DNA序列拷貝數(shù)決定^[15]，而在大麻中將轉(zhuǎn)座子和序列拷貝數(shù)與表型性狀相關(guān)聯(lián)仍然是個(gè)挑戰(zhàn)^[16]。但有研究顯示，大麻性別分化跟反轉(zhuǎn)座子存在著相關(guān)性^[17-18]。Faux等^[19]首次整合了雌雄異株和雌雄同株的連鎖圖譜，并進(jìn)行了QTL分析，將雌雄同株性別基因定位到X染色體上。鑒于大麻植株性別鑒定的經(jīng)濟(jì)效益，前人還開(kāi)發(fā)出性別特異的分子標(biāo)記用于雌雄單株的早期鑒定，如Saka m oto^[20]、Mandolino^[21]利用RAPD技術(shù)分別開(kāi)發(fā)出雄性特異SCAR標(biāo)記MADC1（730?bp）、MADC2（390?bp）;T?rjék等^[22]也開(kāi)發(fā)出雄性特異標(biāo)記MADC5（323?bp）和MADC6（119?bp）。宋書(shū)娟等^[23]和Shao等^[24]分別用RAPD引物OPX09、OPA04和OPF05得出雌性特異的帶型。盡管前人開(kāi)發(fā)了一些性別連鎖的標(biāo)記，但是這些研究主要集中在纖用和藥用大麻，是否適用于籽用大麻品種還屬未知。

本研究以籽用大麻為材料，驗(yàn)證已有的性別連鎖標(biāo)記在籽用大麻的適用性，并開(kāi)發(fā)SCAR標(biāo)記。

1??材料與方法

1.1材料

2018年2月1日在福建省三明市福建農(nóng)林大學(xué)洋中科教基地玻璃溫室內(nèi)分2個(gè)小區(qū)種植榆社麻和汾麻3號(hào)，鋼架大棚中種植榆社麻，每個(gè)品種隨機(jī)挑選100株苗編號(hào)掛牌，取幼嫩葉片于10?mL離心管中，保存于–80?℃冰箱備用;待其開(kāi)花后，記錄編號(hào)單株性別并統(tǒng)計(jì)其品種的雌雄單株總數(shù)。

1.2方法

1.2.1 ?DNA提取??利用改良CTAB法提取基因組DNA^[25]，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度并統(tǒng)一稀釋為50 ng/L，作為模版保存于-20?℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?引物選擇及PCR擴(kuò)增??選用前人文獻(xiàn)中性別鑒定相關(guān)引物^[20-22，24]，送至福州擎科生物科技有限公司合成。利用榆社麻和汾麻3號(hào)兩個(gè)品種的雌雄單株各5個(gè)作為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD引物PCR反應(yīng)體系為10 μL，含2?TaqMaster Mix（試劑購(gòu)自上海進(jìn)岸生物科技有限公司）3.8 μL、ddH₂O 3.8 μL、10 μmol/L引物0.4 μL，DNA模版2 μL;SCAR引物PCR反應(yīng)體系10 μL，含2?TaqMaster mix 3.8 μL、ddH₂O?3.8 μL、10?μmol/L引物對(duì)左右各0.2 μL，DNA模版2 μL。

雖然本研究開(kāi)發(fā)的標(biāo)記與雄性高度連鎖，但試驗(yàn)材料選用的品種還是較少，下一步有必要擴(kuò)大品種數(shù)及品種類型，驗(yàn)證新開(kāi)發(fā)的性別連鎖標(biāo)記是否具有廣泛適用性。在驗(yàn)證前人開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記中，并未發(fā)現(xiàn)雌性特異的條帶。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，有必要通過(guò)集團(tuán)分離分析法結(jié)合測(cè)序技術(shù)對(duì)大麻群體進(jìn)行分析，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)雌性特異分子標(biāo)記甚至雌雄同株特異標(biāo)記，進(jìn)而利用多重PCR反應(yīng)^[32]快速鑒定出大麻三種性別。

4??結(jié)論

本研究驗(yàn)證了3個(gè)性別連鎖標(biāo)記適用于中國(guó)地方籽用大麻品種，并新開(kāi)發(fā)出6個(gè)雄性特異SCAR標(biāo)記，其中，MADC2-8在中國(guó)地方籽用大麻品種中準(zhǔn)確率高達(dá)98.34%。這些標(biāo)記可用于籽用大麻早期性別田間鑒定。

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