p16基因與BAP1蛋白表達(dá)缺失在腹膜惡性間皮瘤診斷和鑒別診斷中的作用

高志斌 王兆平 徐瑛 傅家欣

[摘要] 目的 探討p16基因及BRCA相關(guān)蛋白1（BAP1）表達(dá)缺失在腹膜惡性間皮瘤（PMM）病理診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價值。 方法 選取我院2010年1月～2018年12月確診為PMM的40例以及各30例卵巢漿液性癌和反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生病例作為研究對象。采用熒光原位雜交（FISH）方法檢測p16基因在PMM和反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生中表達(dá)缺失，以及免疫組織化學(xué)方法檢測BAP1在PMM、卵巢漿液性癌及反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生中的表達(dá)缺失，分析兩者在PMM病理診斷和鑒別診斷中的作用。 結(jié)果 PMM標(biāo)本中p16基因表達(dá)缺失率為45%，反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本中缺失率為0。PMM標(biāo)本中p16基因表達(dá)缺失率高于反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。BAP1在PMM、卵巢漿液性癌、反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本中的表達(dá)缺失率分別為65%、0和0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌和反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生的表達(dá)缺失率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。 結(jié)論 p16基因表達(dá)缺失在診斷和鑒別診斷PMM時有明確的診斷價值。BAP1在PMM與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生和卵巢漿液性癌進(jìn)行鑒別診斷時，也有確切的診斷價值，可作為又一項重要的免疫組化診斷指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 腹膜惡性間皮瘤;卵巢漿液性癌;反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生;免疫組織化學(xué);p16;BAP1

[中圖分類號] R735.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）27-0131-04

[Abstract] Objective To investigate the value of p16 gene and BRCA-related protein 1（BAP1） expression loss in the pathological diagnosis and differential diagnosis of peritoneal malignant mesothelioma（PMM）. Methods 40 patients with PMM diagnosed in January 2010 and December 2018， and 30 cases of ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell hyperplasia were selected as subjects. Fluorescence in situ hybridization（FISH） was used to detect the loss of expression of p16 gene in PMM and reactive mesothelial cell proliferation， and immunohistochemistry was used to detect the expression loss of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation. The role of both in the pathological diagnosis and differential diagnosis of PMM was analyzed. Results The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was 45%， and the loss rate in reactive mesothelioma specimens was 0. The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was higher than that in reactive mesothelial cells， and there was significant difference（P<0.01）. The expression loss rate of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma， and reactive mesothelial cell proliferation specimens was 65%， 0 and 0， respectively. There were significant statistical differences in the expression loss rate of BAP1 between PMM and ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation（all P<0.01）. Conclusion The loss of p16 gene expression has a clear diagnostic value in the diagnosis and differential diagnosis of PMM. BAP1 has a definite diagnostic value in the differential diagnosis of PMM with reactive mesothelial cell proliferation and ovarian serous carcinoma， and can be used as another important immunohistochemical diagnostic index.

[Key words] Peritoneal malignant mesothelioma; Ovarian serous carcinoma; Reactive mesothelial cell proliferation; Immunohistochemistry; p16; BAP1

腹膜惡性間皮瘤（peritoneal malignant mesothelioma，PMM）是指來自腹膜間皮細(xì)胞的原發(fā)性高度惡性腫瘤，在病理組織形態(tài)學(xué)上分為上皮型、肉瘤型和混合型，其中上皮型最為常見，而上皮型PMM與同在盆腔的卵巢漿液性癌以及腹膜反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生組織形態(tài)學(xué)上有相似之處，鑒別診斷困難。PMM的診斷通常需要結(jié)合病史、臨床資料、腹水腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)資料，以及病理組織學(xué)形態(tài)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)檢測等方法進(jìn)行綜合判斷才能確診。即使已有多樣的輔助診斷方法，PMM的診斷至今仍然比較困難[1-2]。近年來有關(guān)p16基因和BAP1蛋白表達(dá)缺失在PMM中的研究，國外報道相對較多，國內(nèi)報道很少。本文收集40例PMM病例，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集本院2010年1月～2018年12月臨床病理確診為PMM的病例共40例，全部為女性，年齡44～72歲，中位年齡56歲，其中30例有20～40年手紡石棉史，標(biāo)本均為腫瘤切除術(shù)大標(biāo)本。其中上皮型32例，雙相型8例。40例病例中有19例術(shù)前即被初診為PMM，其他被初診為卵巢癌12例，盆腔惡性腫瘤9例。選取同期30例卵巢漿液性癌（年齡48～76歲，中位年齡58歲）根治術(shù)大標(biāo)本以及30例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生病例標(biāo)本作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)? 組織標(biāo)本采用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片以及HE染色，全部PMM、卵巢漿液性癌以及反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生病例病理診斷均由兩位以上的高級職稱醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核，PMM病理診斷嚴(yán)格參照文獻(xiàn)中要求的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色? 組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化EnVision染色，采用微波抗原熱修復(fù)法，DAB顯色。所用多克隆BAP1一抗（濃縮型）為abcam公司產(chǎn)品，二抗試劑盒為福建邁新生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2.3 FISH檢測? 按照說明書進(jìn)行樣本準(zhǔn)備與變性、探針混合物準(zhǔn)備與變性、玻片洗滌、結(jié)果觀察等。實驗采用北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司的第17號染色體著絲粒探針/第9號染色體p16基因位點特異性探針。GLP p16由四甲基羅丹明標(biāo)記，在熒光顯微鏡下呈紅色信號。CSP17由細(xì)胞綠進(jìn)行標(biāo)記，在熒光顯微鏡下呈綠色信號。結(jié)果判定：正常細(xì)胞均表現(xiàn)為二倍體，細(xì)胞核內(nèi)分別可見2個紅色和2個綠色信號。p16基因缺失表現(xiàn)為每個細(xì)胞核內(nèi)只出現(xiàn)2個信號。每一例計數(shù)至少100個不重疊的細(xì)胞核，≥10%的腫瘤細(xì)胞胞核紅色純合丟失并至少有1個綠色信號被判斷為陽性[5，6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FISH檢測PMM和反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本中p16基因缺失的情況

40例PMM標(biāo)本中，18例（45%）發(fā)生p16基因缺失。30例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本中均未檢測出p16基因缺失。PMM標(biāo)本中p16基因缺失率高于反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.173，P<0.01）（封三圖3、4）。

2.2 免疫組化檢測PMM、反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生和卵巢漿液性癌標(biāo)本中BAP1蛋白的表達(dá)缺失情況

BAP1可同時表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，主要以細(xì)胞核為陽性表達(dá)部位，陽性表達(dá)為出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。40例PMM中26例陰性表達(dá)，BAP1基因表達(dá)缺失率為65%（封三圖3）。30例卵巢漿液性癌均呈陽性表達(dá)，BAP1基因表達(dá)缺失率為0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌的表達(dá)缺失率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=31.023，P<0.01）。30例間皮細(xì)胞反應(yīng)性增生也均呈陽性表達(dá)，BAP1基因表達(dá)缺失率也為0，BAP1在PMM與間皮細(xì)胞反應(yīng)性增生的表達(dá)缺失率差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=31.023，P<0.01）（表1，封三圖5～7）。

3討論

腹膜惡性間皮瘤（PMM）是一種原發(fā)于腹膜的高度惡性腫瘤，臨床上較少見，病因和發(fā)病機制不明，部分病例認(rèn)為與石棉接觸有關(guān)。文獻(xiàn)中報道男性患者居多[5]。本組資料中的病例全部為女性，與文獻(xiàn)報道不一致，這與本地區(qū)從事手紡石棉工作的全部為女性有關(guān)。本組病例中30例有明確手紡石棉史，從事時間1.5～18年不等。

PMM發(fā)病緩慢，潛伏期可長達(dá)15～50年，發(fā)現(xiàn)時已多為晚期，又由于惡性程度極高，多數(shù)患者生存期不超過12個月?；疾≡缙诳沙霈F(xiàn)腹部不適，常被患者忽略，在疾病晚期才出現(xiàn)腹水、腹痛及消化道梗阻等[5]。由于本地區(qū)是國內(nèi)石棉加工行業(yè)的主要區(qū)域之一，2000～2010年女性腹膜惡性間皮瘤發(fā)病率為5.7/100萬，PMM病例相對高發(fā)[7]。因此臨床醫(yī)師在遇到盆腔惡性腫瘤時常會詢問患者有無石棉接觸史，并會根據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)資料考慮到有無PMM這種少見盆腔惡性腫瘤的可能，本組病例中就有19例臨床初診為PMM。

PMM的診斷主要依靠病理學(xué)檢查，結(jié)合有無石棉接觸史以及影像學(xué)改變等資料進(jìn)行綜合分析。在進(jìn)行病理診斷時需要與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生、卵巢漿液性癌等多種良惡性病變進(jìn)行鑒別診斷[4-5]。免疫組織化學(xué)檢測最常采用國際上通用的兩陽、兩陰聯(lián)合診斷方法，但是PMM的病理診斷仍然十分困難[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在惡性間皮瘤細(xì)胞的形成、生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，p16基因異常是最常見的基因改變。p16基因存在于正常細(xì)胞中，它是一個細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶，它調(diào)節(jié)RB通路，使細(xì)胞停滯于G0期或G1期，失去了CDK4的抑制作用，細(xì)胞過度增殖生長，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)常應(yīng)用于檢測惡性間皮瘤p16基因的缺失[6，8]。Illei等[9]利用FISH檢測95例胸膜間皮瘤冷凍標(biāo)本中p16和MTAP基因的缺失情況，發(fā)現(xiàn)p16的純合子缺失在大多數(shù)間皮瘤中均可檢查到，在大多數(shù)病例中MTAP與其共缺失。對間皮瘤的組織學(xué)亞型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與上皮型相比，這種基因缺失更容易發(fā)生在肉瘤型間皮瘤中（包括混合型或者純?nèi)饬鲂停遣]有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由于樣本量較小造成的。多數(shù)研究還顯示[10-13]p16的缺失可用于反應(yīng)性和腫瘤性的間皮細(xì)胞增生的鑒別，而且FISH的敏感性及特異性均高于免疫組織化學(xué)方法，用FISH檢測石蠟包埋組織中9p21純合子缺失是診斷惡性間皮瘤和間皮反應(yīng)性增生的有效方法。本文研究結(jié)果顯示，用FISH法檢測出40例PMM標(biāo)本中p16基因表達(dá)缺失率為45%（18/40），30例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本中表達(dá)缺失率為0（0/30），PMM標(biāo)本中p16基因的缺失率高于間皮細(xì)胞反應(yīng)性增生，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），運用FISH檢測p16基因缺失在診斷和鑒別診斷PMM時有明確的病理診斷價值。

BAP1（BRCA-associated protein 1）是一種腫瘤抑制基因，其基因突變或表達(dá)水平的下調(diào)能夠顯著提高多種腫瘤的易患性。研究表明，BAP1 與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14-15]。一些研究顯示BAP1還可以鑒別間皮細(xì)胞反應(yīng)性增生和惡性間皮瘤[16-18]，與本文研究結(jié)果是一致的，本組資料中30例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生標(biāo)本均呈BAP1陽性表達(dá)（表達(dá)缺失率為0），而40例PMM標(biāo)本中BAP1基因表達(dá)缺失率為65%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。PMM在臨床上常被誤診為卵巢漿液性癌，其在病理組織形態(tài)上也與卵巢漿液性癌十分相似，也需要進(jìn)行鑒別診斷。Andrici J的研究顯示[19-20]，BAP1在卵巢漿液性癌中的表達(dá)缺失率為0.3%，明顯低于PMM的67%，與本文結(jié)果也是基本一致的。本組資料30例卵巢漿液性癌標(biāo)本均呈BAP1基因表達(dá)缺失率為0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌的表達(dá)缺失率差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。本文研究結(jié)果表明BAP1在鑒別PMM與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生和卵巢漿液性癌中均有重要價值。

綜上所述，在PMM標(biāo)本中p16基因常發(fā)生表達(dá)缺失。p16基因表達(dá)缺失在PMM的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。運用FISH檢測p16基因表達(dá)缺失是鑒別PMM與良性間皮細(xì)胞增生的一種有效的方法。而BAP1基因表達(dá)缺失與PMM也密切相關(guān)，這一免疫標(biāo)記可以用于鑒別診斷PMM與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生和卵巢漿液性癌，并能與其他診斷PMM的免疫組化抗體一同運用，提高PMM的病理診斷準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2019-03-19）