油茶子餅粕多糖的降血糖活性研究

徐迪 徐冰彥 張浩 金日生

摘要：為研究油茶子餅粕多糖降血糖的活性，構(gòu)建鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病小鼠，研究油茶子餅粕多糖對小鼠造模前后空腹血糖、各臟器指數(shù)以及肝臟、腎臟組織中丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，油茶子餅粕多糖顯著影響造模前后小鼠的血糖值及各臟器指數(shù)，且MDA含量顯著降低，抗氧化酶活性升高，說明油茶子餅粕多糖具有顯著的降血糖活性。

關(guān)鍵詞：油茶子餅粕多糖;降血糖活性;丙二醛;抗氧化酶活性

中圖分類號：TS229;TQ281? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0147-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.035? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on hypoglycemic activity of polysaccharide from camellia seed cake

XU Di1，XU Bing-yan2，ZHANG Hao2，JIN Ri-sheng2

（1.School of Biological Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，Anhui，China;

2.Engineering Research Center of Bioprocess Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： To study the hypoglycemic activity of camellia seed cake polysaccharide， the streptozotocin （STZ）-induced diabetic mice were constructed to study the effect of camellia seed polysaccharide on fasting blood glucose， several organ indexes and the content of malondialdehyde（MDA） and antioxidant enzyme activity in liver and kidney tissues of mice before and after modeling were studied. The results showed that the camellia seed cake polysaccharide significantly influenced the blood glucose level and organ indexes of mice， and the content of MDA was obviously decreased and the activity of antioxidant enzyme was increased， which indicated that camellia seed cake polysaccharide had significant hypoglycemic activity.

Key words： camellia seed cake polysaccharide; hypoglycemic activity; malondialdehyde; antioxidant enzyme activity

多糖（Polysaccharide）是一類由10個以上單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的具有多種生物活性的生物大分子[1]。它具有抗氧化、提高機體免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多方面的生物活性[2-6]。多糖已逐漸展示出越來越廣泛的應用前景，目前，已有近百種植物多糖被廣泛應用到醫(yī)藥及食品中[7]。

油茶子餅粕（俗稱茶枯）是油茶子機械榨油后的副產(chǎn)物，其中殘留有茶多糖、茶油、茶皂素、淀粉、蛋白質(zhì)及纖維素等多種有用物質(zhì)[8]。但由于油茶子餅粕味苦、辛辣等原因，大多數(shù)的油茶子餅粕都被遺棄或者焚燒[9]，造成了極大的資源浪費。然而研究表明，油茶子餅粕中含有的茶多糖（含量為20%～40%[10]）具有降血糖[11]、降血脂[12]、抗氧化[13，14]、抗腫瘤[15，16]、抗菌[17]等多方面的生物活性作用。因此，開展油茶子餅粕多糖的研究對于油茶子資源的綜合利用具有顯著的意義。

以油茶子餅粕多糖為研究對象，研究油茶子餅粕多糖對鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病小鼠的降血糖活性，考察油茶子餅粕多糖對糖尿病的改善作用，旨在為開發(fā)油茶子餅粕多糖相關(guān)的藥品及保健食品奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

三諾血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）;Sartorious精密電子天平（北京賽多斯天平有限公司）;LG10-2.4A離心機（北京醫(yī)用離心機廠）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）;ELGA超純水機（英國Veolia Water Syestem公司）;752N紫外可見分光光度計（上海精科分析儀器有限公司）;imark酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

油茶子餅粕多糖參考文獻[18]的方法，自制;SPF級昆明小鼠，雄鼠，體重（20±2） g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心;普通飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司;鏈脲佐菌素（STZ）、胰島素（INS）ELISA檢測試劑盒購自Sigma公司;格列本脲片（2.5 mg/片）購自天津太平洋制藥有限公司;丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所;生理鹽水購自山東康寧藥業(yè)有限公司;檸檬酸和檸檬酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 高血糖小鼠模型的建立

1）試劑的配制。①檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的配制。精確稱取2.1 g檸檬酸置于100 mL容量瓶中，加入去離子水定容，配制得溶液A;精確稱取2.94 g檸檬酸鈉置于100 mL容量瓶中，加入去離子水定容，配制得溶液B。②STZ溶液的配制。分別量取28 mL 溶液A、22 mL溶液B置于100 mL容量瓶中，加入去離子水定容，得溶液AB的混合液，即為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5。稱取一定量的STZ，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解STZ，使得溶液中STZ濃度為2%。STZ溶液不宜存放，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）造模方法。健康雄性昆明小鼠，預分組并標號，保持室溫25 ℃，正常晝夜交替下普通飼料適應飼養(yǎng)一周，隨機取15只小鼠，禁食12 h（自由飲水），測定空腹血糖值，作為小鼠的基礎(chǔ)血糖值。取8只小鼠作空白對照組（NC），正常飼養(yǎng)。剩余小鼠禁食24 h（自由飲水），腹腔注射STZ（用前新鮮配制）造模，小鼠120 mg/kg BW.ip。5～7 d后小鼠禁食12 h（自由飲水），尾靜脈取血，測定造模小鼠空腹血糖值，血糖值>16.8 mmol/L且出現(xiàn)明顯“三多一少”癥狀（即多食、多飲、多尿及體重減輕）的小鼠即為高血糖模型成功的小鼠[19]。

1.2.2? 成模小鼠的分組及給藥? 取造模成功的小鼠40只，隨機分為5組，加上正常小鼠的空白對照組，總計6個組，進行每天灌胃試驗，灌胃時間持續(xù)4周，保持正常晝夜交替，室內(nèi)溫度在25 ℃，室內(nèi)通風良好，室內(nèi)相對濕度維持在45%～65%，小鼠每日正常飲水攝食。

第一組（n=8）：正常對照組，正常小鼠，給予正常飲水攝食，灌胃等量生理鹽水4周。

第二組（n=8）：糖尿病陽性對照組，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日給予正常攝食飲水，灌胃等量生理鹽水4周。

第三組（n=8）：格列本脲陽性對照組，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日給予正常攝食飲水，灌胃10 mg/（kg·d）格列本脲片4周。

第四組（n=8）：多糖低劑量組，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日給予正常攝食飲水，灌胃50 mg/（kg·d）油茶子餅粕多糖4周。

第五組（n=8）：多糖中劑量組，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日給予正常攝食飲水，灌胃100 mg/（kg·d）油茶子餅粕多糖4周。

第六組（n=8）：多糖高劑量組，血糖值>16.8 mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日給予正常攝食飲水，灌胃200 mg/（kg·d）油茶子餅粕多糖4周。

1.2.3? 小鼠各項指數(shù)的測定? 試驗過程中，密切觀察小鼠的日常行為活動，每周測定并記錄各組小鼠的體重，攝食量、飲水量及排尿量，空腹血糖值（測定前禁食12 h，不禁水），各臟器指數(shù)（小鼠各臟器的重量與小鼠體重的比值[20]）。

1.2.4? 小鼠肝臟、腎臟組織中MDA含量及抗氧化酶活性的測定? 取小鼠肝臟、腎臟組織塊（0.2～1.0 g）用冰冷的生理鹽水漂洗，濾紙拭干，稱重，用量筒量取遇冷的生理鹽水，用眼科小剪將組織盡量剪碎，倒入玻璃勻漿管中，充分研磨，使組織勻漿化，制成10%的組織勻漿，離心，取組織勻漿上層清液置于10 mL離心管中，于-60 ℃超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書測定各組小鼠肝臟、腎臟組織中MDA、CAT、T-SOD、GSH-Px含量。

蛋白質(zhì)分子基團中含有-NH3+，在蛋白質(zhì)標準溶液中加入顯色劑，-NH3+立刻與棕紅色考馬斯亮藍染料中的陰離子結(jié)合，溶液呈藍色，用紫外可見分光光度計在波長595 nm處測定其吸光值，由此可計算出小鼠組織中蛋白質(zhì)含量。

1）小鼠肝臟、腎臟勻漿中MDA含量計算公式如下：

MDA含量（nmol/mg）=×標準品濃度（10 nmol/mL）÷待測樣本蛋白濃度（mg/mL）

2）小鼠肝臟、腎臟勻漿中CAT活力的計算公式如下：

CAT活力（U/mg）=（對照管OD值-測定管OD值）×27÷反應時間（60 s）÷[待測蛋白含量（mg/mL）×取樣量]

3）小鼠肝臟、腎臟勻漿中SOD活力計算公式如下：

SOD活力（U/mg）=÷50%×÷組織中蛋白含量（mg/mL）

4）小鼠肝臟、腎臟勻漿中GSH-Px酶活力計算公式如下：

組織GSH-Px酶活力=×標準品濃度（20 μmol/mL）×稀釋倍數(shù)（5）÷反應時間÷（待測樣本蛋白濃度×取樣量）

5）小鼠肝臟、腎臟勻漿中蛋白質(zhì)含量的計算公式如下：

蛋白濃度（nmol/mg）=×蛋白標準品濃度（0.563 mg/mL）×樣本測定前稀釋倍數(shù)

1.3? 數(shù)據(jù)分析

均進行3組以上平行試驗，所得數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學分析后用平均值±標準差表示，用Microsoft Excel和Origin 9.0對數(shù)據(jù)進行整理和繪圖，用SPSS 18.0對組間差異進行分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 小鼠一般狀況的觀察

從分組開始，對各分組小鼠的一般狀況進行觀察，記錄見表1。正常對照組小鼠飲食飲水均正常，長勢良好，毛發(fā)濃密而光滑，精神狀態(tài)佳;造模成功的各組糖尿病小鼠具有明顯的“三多一少”癥狀，多食多飲多尿，墊料潮濕，且小鼠精神狀態(tài)不佳，隨著天數(shù)的增加，高血糖模型空白對照組的小鼠“三多一少”癥狀越來越嚴重，日益消瘦，沒有緩解;灌胃油茶子餅粕多糖低劑量組小鼠的癥狀與模型空白對照組小鼠癥狀相似，沒有顯著改善，而灌胃油茶子餅粕多糖的中劑量組和高劑量組小鼠較高血糖模型空白對照組和低劑量組小鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，多食多飲多尿癥狀隨著天數(shù)增加略有改善，到灌胃第3周，油茶子餅粕多糖高劑量組及格列本脲陽性對照組小鼠效果尤為顯著，精神狀態(tài)良好，多食多飲多尿癥狀明顯好轉(zhuǎn)，墊料較為干燥。由此可知，油茶子餅粕多糖具有降血糖的效果且與劑量有依賴關(guān)系，劑量組越高的油茶子餅粕多糖降血糖效果越好。

2.2? 小鼠各項指數(shù)的測定

2.2.1? 小鼠攝食量、飲水量及排尿量的測定? 如圖1、圖2、圖3所示，正常對照組小鼠攝食量、飲水量及排尿量均較少，維持穩(wěn)定狀態(tài)，隨著小鼠體重增加僅有小幅度增長趨勢，因此墊料干燥，無異味;而造模成功的高血糖組小鼠均出現(xiàn)明顯的“三多一少”癥狀，各組高血糖小鼠的攝食量、飲水量及排尿量均有顯著增加，高血糖模型空白對照組小鼠的攝食量、飲水量及排尿量一直處于較高水平，僅有小幅度緩解現(xiàn)象，可能是因為造模成功后在沒有任何藥物干預治療的情況下，小鼠機體自身又具有一定的自愈功能，因此，癥狀有輕微緩解，小鼠的攝食量、飲水量及排尿量略有減少，但與陽性藥物及多糖組小鼠干預治療的效果相比小鼠的自愈功能較弱，自身恢復速度十分緩慢。試驗進行到灌胃第2周及第4周結(jié)束，油茶子餅粕多糖的各劑量組高血糖小鼠的攝食量、飲水量及排尿量均有不同程度的減少，多糖低劑量組和中劑量組的高血糖小鼠的飲水量、排尿量有小幅度的減少，而多糖高劑量組對糖尿病小鼠攝食量、飲水量及排尿量的影響顯著高于多糖低和中劑量組，小鼠的攝食量、飲水量及排尿量均顯著下降。由圖中數(shù)據(jù)可知，從某種程度上來說，給藥多糖高劑量組4周后小鼠表觀指標的恢復情況與陽性藥物格列本脲相比所差無幾，多糖高劑量組可以達到陽性藥物格列本脲的降血糖效果。

2.2.2? 小鼠體重測定? 如圖4所示，每周測定1次各組小鼠的體重，并對小鼠初始體重、成模后體重、灌胃處理2周及灌胃處理4周后的體重進行詳細記錄。由試驗結(jié)果（圖4）可知，給藥前各組小鼠的體重均無明顯差異，隨著試驗的進行，正常組小鼠體重呈均勻增長的趨勢，而造模成功的糖尿病小鼠的體重與正常組小鼠體重相比，均有顯著的減輕，明顯低于正常小鼠的體重水平。試驗給藥2周及4周后，高血糖空白對照組小鼠的體重呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，灌胃油茶子餅粕多糖中和高劑量組的小鼠及陽性對照組小鼠的體重維持造模后的體重水平或略有所增加，說明油茶子餅粕多糖制品能夠有效緩解糖尿病引起的各種癥狀，對糖尿病引起的小鼠體重減輕現(xiàn)象有較為明顯的抑制作用。

2.2.3? 小鼠空腹血糖值的測定? 如圖5所示，每周測定1次小鼠的空腹血糖值（測定前禁食12 h，不禁水），并對小鼠的基礎(chǔ)血糖值、成模后血糖值、灌胃處理2周及灌胃4周后的血糖值進行仔細記錄。造模前，正常小鼠空腹血糖平均值維持在3～4，而造模后的高血糖組小鼠空腹血糖較正常組小鼠顯著升高，平均值可達到20～24，說明糖尿病小鼠造模成功。給藥2周及給藥4周后，分別測定各組小鼠的空腹血糖值，高血糖組模型對照組小鼠血糖水平略呈上升趨勢，灌胃油茶子多糖的低和中劑量組小鼠的血糖水平略有降低，但效果不明顯，而灌胃油茶子多糖的高劑量組及格列本脲陽性對照組小鼠的空腹血糖水平都有顯著降低。對比油茶子餅粕多糖低、中、高劑量組小鼠的空腹血糖值變化情況發(fā)現(xiàn)，油茶子餅粕多糖的降血糖效果與劑量有依賴關(guān)系，劑量組越高的油茶子餅粕多糖降血糖效果越好。

2.2.4? 小鼠各臟器指數(shù)的測定? 給藥4周后，各種小鼠肝臟、腎臟及脾臟的器官指數(shù)如表2所示。高血糖模型空白對照組較正常對照組小鼠的肝臟、腎臟及脾臟的指數(shù)均有極顯著上升，說明在STZ造模過程中對小鼠肝臟、腎臟及脾臟等各器官均造成了一定的損傷。給藥4周后，格列本脲陽性對照組及多糖各劑量組小鼠的各器官指數(shù)均有不同程度的下降，且油茶子餅粕多糖高劑量組的小鼠各器官指數(shù)的下降趨勢更明顯，由此可知，油茶子餅粕多糖對恢復肝臟、腎臟及脾臟的臟器指數(shù)有顯著功效，且恢復效果與劑量有依賴關(guān)系，劑量組越高的油茶子餅粕多糖恢復效果越好。

2.3? 小鼠肝臟、腎臟中MDA含量和抗氧化酶測定

各組小鼠的肝臟、腎臟中MDA含量及抗氧化酶的活性測定如表3、表4所示，高血糖模型對照組小鼠肝臟及腎臟中的MDA含量均有明顯的上升，這是由于鏈脲佐菌素成模的高血糖致使小鼠體內(nèi)新陳代謝紊亂，體內(nèi)氧自由基反應及其與體內(nèi)新陳代謝系統(tǒng)處于的平衡關(guān)系被打破，產(chǎn)生自由基連鎖反應而導致小鼠體內(nèi)肝臟、腎臟的損傷，而多糖劑量組中小鼠肝臟、腎臟的MDA含量均有明顯的降低，給藥4周后，油茶子餅粕多糖各劑量組小鼠肝臟、腎臟中MDA含量及GSH-Px含量較高血糖模型對照組小鼠有顯著降低，多糖高劑量組效果最為顯著。

高血糖模型對照組小鼠肝臟的SOD和CAT活性顯著降低，SOD和CAT在體內(nèi)抗氧化過程中起著至關(guān)重要的作用，是機體不可缺少的抗氧化劑及抗氧化酶類。油茶子多糖灌胃4周后，小鼠肝臟中的SOD和CAT顯著上升，且油茶子多糖劑量組越高的小鼠SOD和CAT上升越明顯。本試驗表明油茶子餅粕多糖不僅能降低血糖，還能增強高血糖小鼠肝臟及腎臟的抗氧化能力，增強小鼠體內(nèi)清除自由基的能力，從而減輕自由基對小鼠胰島β細胞的損傷，且恢復效果與劑量有依賴關(guān)系，劑量組越高的油茶子餅粕多糖降血糖效果越好。

3? 小結(jié)

通過試驗探究了油茶子餅粕多糖對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病小鼠降血糖活性的影響，結(jié)果表明，油茶子餅粕多糖均能有效緩解糖尿病小鼠的“三多一少”癥狀，多糖灌胃試驗4周能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平，且有效降低了高血糖小鼠肝臟、腎臟的MDA水平，同時提高了高血糖小鼠肝臟、腎臟的GSH-PX、CAT及SOD活性。且油茶子餅粕多糖的降血糖效果與劑量有依賴關(guān)系，劑量組越高的油茶子餅粕多糖降血糖效果越好。綜上所述，油茶子餅粕多糖具有顯著的降血糖活性，為油茶餅粕多糖相關(guān)功能產(chǎn)品的進一步深入研究及開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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