天然抗氧化劑二氫楊梅素的提取工藝比較研究

鄭琳 劉盼盼 王雪萍 高士偉 龔自明

摘要：以湖北省恩施州富硒土壤上生長(zhǎng)的藤茶為原料，采用3種方法提取天然抗氧化劑二氫楊梅素（DMY）。結(jié)果顯示，超聲輔助提取條件下，料液比1∶70（g∶mL），用80%乙醇溶液常溫提取50 min，提取液中DMY含量較高，為19.010%;微波輔助提取條件下，560 W功率，料液比1∶70（g∶mL），用60%乙醇溶液提取120 s，提取液中DMY含量較高，為18.174%;破壁式輔助提取條件下，常溫25 ℃，料液比1∶50（g∶mL），用100%純乙醇溶液提取5 min，提取液中DMY含量較高，為15.172%;三者相比較，各有優(yōu)勢(shì)，超聲提取DMY含量較高，微波提取用時(shí)短，破壁式提取批次處理量大。

關(guān)鍵詞：天然抗氧化劑;二氫楊梅素（DMY）;藤茶;提取工藝

中圖分類號(hào)：R93? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）20-0137-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.033? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The comparative study on extraction of natural antioxidant-dihydromyricetin

ZHENG Lin，LIU Pan-pan，WANG Xue-ping，GAO Shi-wei，GONG Zi-ming

（Fruit and Tea Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： Using Ampelopsis grossedentata which is growing on the soil（Enshi，Hubei Province） rich in selenium as material， the natural antioxidant dihydromyricetin （DMY） was extracted by three methods. The results showed that the optimum extraction process were the ratio of tea material to water 1∶70（g∶mL），50 min， 80% ethanol solution at room temperature under the condition of ultrasound assisted extraction，the content of DMY in tea soup was 19.010%. Under the condition of microwave assisted extraction， the optimum extraction process were 560 W power， the ratio of tea material to water 1∶70（g∶mL），120 s，60% ethanol solution， the content of DMY in tea soup was 18.174%. Under the condition of wall-breaking assisted extraction，the optimum extraction process were 50 min，the ratio of tea material to 100% pure ethanol solution 1∶50（g∶mL） at room temperature， the content of DMY in tea soup was 15.172%. Compared with the three methods， the ultrasonic extraction rate is high， the microwave extraction time is short， and the wall-breaking extraction batch processing is large.

Key words： natural antioxidant; DMY; Ampelopsis grossedentata; extraction process

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的莖葉，是一種多年生的藤本植物。藤茶是目前所有被發(fā)現(xiàn)的植物中含黃酮最高的，故被稱為“黃酮之王”。黃酮主要成分為二氫楊梅素（DMY），具有抑菌消炎、止咳化痰、降“三高”、抗癌等功能[1-6]，并且可以有效抗氧化[7-12]，近年來(lái)備受關(guān)注，有望作為一種天然無(wú)毒的抗氧化劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。本研究以湖北省恩施土家族自治州富硒土壤上生長(zhǎng)的藤茶為原料，比較分析超聲提取、微波提取和破壁式提取3種方法對(duì)DMY成分的提取效果，為工業(yè)化綠色高效提取DMY提供理論基礎(chǔ)，并為提高藤茶利用率提供技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 藤茶原料? 原料來(lái)自湖北省恩施州來(lái)鳳縣金藤子專業(yè)合作社。

1.1.2? 試驗(yàn)試劑? 乙醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），冰乙酸、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司），二氫楊梅素（DMY）標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，純度98%）。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 超聲提取? 單因素試驗(yàn)：超聲提取時(shí)間選取20、30、40、50、60、70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比選取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g∶mL，下同），以此研究各因素對(duì)藤茶中DMY提取的影響。

正交試驗(yàn)：通過(guò)單因素試驗(yàn)分析各因素對(duì)DMY提取量的影響，確定較佳的單因素試驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為主要影響因素，各選出3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1）。

1.2.2? 微波提取? 單因素試驗(yàn)：微波提取時(shí)間選取30、60、90、120、150、180 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比選取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，微波功率選取70、210、350、560、700 W，以此研究各因素對(duì)藤茶中DMY提取的影響。

正交試驗(yàn)：通過(guò)單因素試驗(yàn)分析各因素對(duì)DMY提取量的影響，確定較佳的單因素試驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以微波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率為主要影響因素，各選出3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表2）。

1.2.3? 破壁式提取? 破壁式提取選用JHBE-50S閃式提取器，基于組織破碎原理將物料快速破碎至適當(dāng)粒度，同時(shí)伴有高速攪拌、超強(qiáng)振動(dòng)、負(fù)壓滲濾等作用實(shí)現(xiàn)提取目的，最大限度保留植物有效成分不會(huì)受熱破壞，溶劑用量小，提取時(shí)間短，效率高。

單因素試驗(yàn)：破壁式提取時(shí)間選取1、2、3、4、5、6 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比選取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，以此研究各因素對(duì)藤茶中DMY提取的影響。

正交試驗(yàn)：通過(guò)單因素試驗(yàn)分析各因素對(duì)DMY提取量的影響，確定較佳的單因素試驗(yàn)條件范圍，在此基礎(chǔ)上，以破壁時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為主要影響因素，各選出3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表3）。

1.3? 高效液相色譜分析檢測(cè)

色譜柱為Agilent TC-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相為甲醇-水（3∶7）（用冰乙酸調(diào)pH至3.5）。流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為292 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取20 mg DMY標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶解于上述流動(dòng)相，精確定容至25.0 mL，得到0.8 mg/mL母液。然后取適量上述溶液，分別稀釋至1、4、8、16、32倍，即得濃度梯度為0.800、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定得到的色譜峰面積和已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，得回歸分析曲線y=3×10-8x+0.012，R2=0.999，x為峰面積，y為樣品濃度（mg/mL）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 超聲提取

2.1.1? 單因素試驗(yàn)結(jié)果? 固-液提取過(guò)程分為3步[7]：①溶劑進(jìn)入固體內(nèi)部，溶質(zhì)溶解;②溶質(zhì)從固體內(nèi)部到表面;③溶質(zhì)溶解液從固體表面到溶劑中。圖1表明，藤茶提取液中DMY含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)。分析其原因在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，DMY浸出量增加，但當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)一定值后，DMY因氧化等原因發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，含量反而有所下降。

圖2表明，80%乙醇對(duì)于藤茶中DMY的提取具有明顯作用，提取液中DMY的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先升后降的趨勢(shì)。

圖3表明，在選取的料液比范圍內(nèi)隨著溶劑的增加，提取液中DMY含量一直呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶60后，再增加提取溶劑量，DMY含量反而略有下降。分析其原因?yàn)椋禾俨璺壑兴腄MY量是一定的，當(dāng)提取溶劑到達(dá)一定量后，DMY已全部提取出，再增加溶劑量也沒(méi)有明顯增加，反而會(huì)因溫度等原因加快DMY的氧化。

2.1.2? 正交試驗(yàn)確定超聲提取DMY的最佳條件? 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲時(shí)間選取40、50、60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取60%、80%、100%，料液比選取1∶50、1∶60、1∶70，正交分析結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

由表4可見(jiàn)，提取二氫楊梅素含量最高的處理組合為A2B2C3，分析各因素k的變化率得到的最優(yōu)處理組合為A1B2C3，但由表5可知，B因素對(duì)結(jié)果的影響顯著，A因素和C因素對(duì)結(jié)果的影響不顯著。綜合表4和表5中的結(jié)果，并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到最佳可行的提取工藝組合為A2B2C3，即提取時(shí)間50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶70，在此條件下提取液中DMY含量為19.010%。

2.2? 微波提取

2.2.1? 單因素試驗(yàn)結(jié)果? 圖4表明，藤茶提取液中DMY含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)，提取時(shí)間為60 s時(shí)，DMY含量達(dá)到最高，隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，DMY因氧化等原因發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，含量反而有所下降。圖5表明，藤茶提取液中DMY含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先升后降的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)DMY含量達(dá)到最大，隨后緩慢下降。

圖6表明，在選取的料液比范圍內(nèi)隨著提取用水量的增加，藤茶提取液中DMY含量一直呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶60后，再增加提取用水量，反而會(huì)因溫度等原因加快DMY的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，DMY含量降低。

圖7表明，微波功率增大，藤茶提取液中DMY含量會(huì)隨之提高，當(dāng)達(dá)到560 W時(shí)，DMY含量達(dá)到最高，微波功率提高到700 W時(shí)，會(huì)因溫度等原因破壞DMY成分，含量反而下降。

2.2.2? 正交試驗(yàn)確定微波提取DMY的最佳條件? 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，提取時(shí)間選取60、90、120 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取60%、80%、100%，料液比選取1∶50、1∶60、1∶70，微波功率選取350、560、700 W，正交分析結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

由表6可知，從藤茶中提取DMY含量最高的處理組合為A3B1C3D2，分析各因素k的變化率得到的最優(yōu)處理組合為A2B1C3D2，但由表7可知，A、C和D因素對(duì)結(jié)果的影響均不顯著，只有B因素對(duì)結(jié)果的影響顯著。綜合表6和表7結(jié)果，并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到最佳可行的提取工藝組合為A3B1C3D2，即微波時(shí)間120 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶70，微波功率560 W，在此條件下藤茶提取液中DMY含量為18.174%。

2.3? 破壁式提取

2.3.1? 單因素試驗(yàn)結(jié)果? 圖8表明，藤茶提取液中DMY含量隨著破壁時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)，提取時(shí)間為5 min時(shí)，DMY含量達(dá)到最高，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，DMY因氧化等原因發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，含量反而下降。

圖9表明，藤茶提取液中DMY含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%和無(wú)水乙醇條件下，DMY含量相差不大。

圖10表明，在選取的料液比范圍內(nèi)隨著提取用水量的增加，藤茶提取液中DMY含量一直呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶50后，再增加提取用水量，對(duì)DMY的浸出影響不大，反而會(huì)因溫度等原因加快DMY的氧化，同時(shí)提高生產(chǎn)成本。

2.3.2? 正交試驗(yàn)確定破壁式提取DMY的最佳條件? 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，破壁時(shí)間選取3、4、5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)選取60%、80%、100%，料液比選取1∶40、1∶50、1∶60，正交分析結(jié)果見(jiàn)表8和表9。

由表8可知，采用破壁式方法提取DMY，得到DMY含量最高的處理組合為A3B3C2，分析各因素k的變化率得到的最優(yōu)處理組合為A3B2C2，但由表9可知，A因素對(duì)結(jié)果的影響顯著，B因素和C因素對(duì)結(jié)果的影響不顯著。綜合表8和表9結(jié)果，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到最佳可行提取工藝組合為A3B3C2，即破壁時(shí)間5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)100%，料液比1∶50，在此條件下提取液中DMY含量為15.172%。

3? 小結(jié)

超聲輔助提取條件下，最佳提取工藝組合為超聲時(shí)間50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶70，在此條件下提取液中DMY含量為19.010%。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中DMY含量的影響顯著，超聲時(shí)間和料液比對(duì)提取液中DMY含量的影響不顯著。

微波輔助提取條件下，最佳提取工藝組合為微波時(shí)間120 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶70，微波功率560 W，在此條件下提取液中DMY含量為18.174%。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中DMY含量的影響顯著，微波時(shí)間、微波功率和料液比對(duì)提取液中DMY含量的影響均不顯著。

破壁式輔助提取條件下，最佳提取工藝組合為破壁時(shí)間5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)100%，料液比1∶50，在此條件下提取液中DMY含量為15.172%。破壁時(shí)間對(duì)提取液中DMY含量的影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)提取液中DMY含量的影響不顯著。

3種提取條件相比較，超聲提取條件下提取液中DMY含量較高，但提取時(shí)間長(zhǎng)，適用于提取較高含量、較高純度的DMY;微波提取用時(shí)較短，但批次處理量小，適用于快速提取;破壁式提取條件批次處理量大，溶劑損耗較小，但是提取率較低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

4? 討論

以湖北省恩施州富硒土壤上生長(zhǎng)的藤茶為原料，比較分析了超聲提取、微波提取和破壁式提取3種方法對(duì)二氫楊梅素成分的提取效果，均綠色高效。預(yù)計(jì)從兩方面著手開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)：一是放大驗(yàn)證不同提取方法的提取效果，為工業(yè)化提取二氫楊梅素提供數(shù)據(jù)支撐;二是分析二氫楊梅素的抗氧化功效，并將其應(yīng)用于食品生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐? 超，李小鳳.藤茶抑菌作用的研究[J].輕工科技，2015（7）：9-11.

[2] 羅文敏，孫? 超，向? 準(zhǔn)，等.藤茶止咳化痰藥效學(xué)研究[J].貴州科學(xué)，2014，32（6）：58-60.

[3] 陳玉瓊，倪德江，程? 倩，等.藤茶總黃酮及DMY降血脂作用研究[J].茶葉科學(xué)，2007，27（3）：221-225.

[4] 譚勝藍(lán)，陳? 磊，何桂霞，等.DMY心血管保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2017（3）：339-343.

[5] 逯鳳肖，郁建平，秦? 湉，等.藤茶中DMY對(duì)糖尿病小鼠血糖和血脂的影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2015，34（6）：89-92.

[6] 白? 倩，謝? 琦，彭曉莉，等.DMY通過(guò)抑制甲基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞PTEN基因去甲基化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（1）：20-24.

[7] 歐賢紅，葉? 勇，黃秋潔，等.藤茶抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25（2）：245-248.

[8] 王恩花，秦澤華，楊禮壽，等.藤茶源二氫楊梅素對(duì)貴州傳統(tǒng)香腸的抗氧化活性評(píng)價(jià)[J].食品科技，2017（6）：128-132.

[9] 石治敏，楊麗麗，沈天嬌，等.二氫楊梅素對(duì)4種植物油脂抗氧化作用研究[J].中國(guó)油脂，2017（6）：89-92.

[10] 王恩花，楊禮壽，逯鳳肖，等.二氫楊梅素體外抗氧化活性研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2016，35（3）：86-90，62.

[11] 馬? 玲，楊繼國(guó)，廖文鎮(zhèn)，等.二氫楊梅素的分離純化及其細(xì)胞內(nèi)抗氧化和體外結(jié)合膽酸鹽能力的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（5）：157-162.

[12] 雷紅靈，陸海波，蔡金洲，等.硒對(duì)藤茶抗氧化酶活性及有效成分的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（3）：321-325.