蝎毒素多肽與鈉通道特異性結(jié)合位點(diǎn)研究進(jìn)展

章旭日，白占濤，3，劉 霞，3*

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.延安大學(xué)多肽資源藥物研究中心；3.陜西省區(qū)域生物資源保育利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000)

動物毒液是產(chǎn)毒動物捕捉獵物和抵擋天敵的重要工具，其成分復(fù)雜，其中的有效成分即毒素通常是肽和小分子化合物。肽類毒素具有不同的氨基酸序列、多肽長度、二硫鍵及折疊模式，通常由20到70個氨基酸殘基、2到4對二硫鍵組成，二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。毒素能靶向作用于各類離子通道而影響其正常運(yùn)作。根據(jù)作用于通道上的方式，毒素分為孔區(qū)阻滯劑毒素和門控調(diào)節(jié)劑毒素，蝎毒素多肽屬于門控調(diào)節(jié)劑毒素，能夠與鈉通道結(jié)合影響其門控特性，因此是研究靶向鈉通道藥物很好的工具。

研究普遍認(rèn)為，蝎毒素多肽主要與通道上的VSD(Voltage-sensing Domain)結(jié)合而影響其門控特性，但二者結(jié)合的詳細(xì)分子結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制目前尚不明確。近來，顏寧組利用高分辨冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)，同為門控調(diào)節(jié)劑的蜘蛛毒素Dc1a除與VSD結(jié)合外，還與細(xì)胞外環(huán)(連接著孔螺旋P2和孔區(qū)域中的S6區(qū)段)有結(jié)合點(diǎn)。正是基于這一新發(fā)現(xiàn)的提示以及目前該領(lǐng)域研究的諸多疑問，本文通過聚焦蝎毒素多肽與鈉通道特異性結(jié)合位點(diǎn)研究的新進(jìn)展，為該領(lǐng)域研究提出新思路和可供借鑒的一些參考。

1 蝎毒素

蝎毒素由20至70個氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)特征在于每個α螺旋通過2對二硫鍵與反向平行β折疊連接，在N端具三維結(jié)構(gòu)，或一個延伸結(jié)構(gòu)，或β片層[1]。蝎毒素的分類方法很多，根據(jù)不同的作用機(jī)制可分為神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素；根據(jù)作用的對象，它分為哺乳動物和昆蟲毒素；它還可以根據(jù)相對分子質(zhì)量分為長鏈和短鏈蝎毒素，長鏈蝎毒素含有60到70個氨基酸殘基。4對二硫鍵，主要作用于興奮性細(xì)胞的鈉通道；短鏈蝎毒素含20到40個氨基酸殘基，3至4對二硫鍵，并且可以特異性作用于鉀通道、氯通道和鈣通道。不同類型蝎毒素多肽的結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)是不同的，因此根據(jù)蝎毒素的藥理學(xué)和電生理學(xué)特性，將蝎毒素分為α蝎毒素和β蝎毒素兩種，α蝎毒素作用在鈉通道上位點(diǎn)3，減慢鈉通道的失活過程，延長鈉通道的開放時(shí)間；β蝎毒素對鈉通道位點(diǎn)4的作用是影響鈉通道的激活過程，激活相電壓向超極化方向移動，對鈉通道的失活無影響[2]。

2 鈉離子通道

鈉通道在產(chǎn)生膜興奮性中起關(guān)鍵作用，并且是神經(jīng)毒素的常見靶點(diǎn)。鈉通道由一個α亞基(260 kD)，一個或數(shù)個β亞基(33～36 kD)組成[3，4]。α亞基是鈉通道的功能性亞基，由四個結(jié)構(gòu)域組成(DomainⅠ～DomainⅣ，DⅠ～DⅣ)，每個Domain含有六個跨膜片段(S1～S6)。這些結(jié)構(gòu)相似但不相同的結(jié)構(gòu)域由S1～S4電壓敏感區(qū)組成，S4片段中每3個氨基酸殘基中就有一個帶正電的氨基酸。中間間隔2個疏水性氨基酸，其中正電荷氨基酸對膜電位變化產(chǎn)生反應(yīng)，使通道產(chǎn)生開放或者關(guān)閉的構(gòu)象。S5～S6則與每個結(jié)構(gòu)域螺旋形排列在一起，在膜中形成鈉離子選擇孔。在哺乳動物中，鈉通道根據(jù)α亞基結(jié)構(gòu)的不同，可分為Nav1.1～Nav1.9和Nax十個亞型。其中亞型Nav1.1～Nav1.3和Nav1.6分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Nav1.4、Nav1.5分布在肌肉組織中。Nav1.7～Nav1.9分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)[5]。不同的鈉通道亞型具有相似的結(jié)構(gòu)但功能不同。還可以根據(jù)其對河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是否敏感，鈉通道亞型可以分為TTX敏感型(TTX-S)和TTX不敏感型(TTX-R)[6，7]，其中Nav1.1～Nav1.4、Nav1.6、Nav1.7屬于TTX-S，并且納摩爾濃度的TTX就能夠抑制TTX敏感型，而TTX不敏感型只對微摩爾濃度的TTX具有反應(yīng)[8]。離子通道和小分子配體組合調(diào)控通道開放或者關(guān)閉，從而控制鈉離子的滲透性。其中鈉通道在生理調(diào)控中起關(guān)鍵作用，因?yàn)槠鋸V泛分布表達(dá)在各種神經(jīng)元中，當(dāng)膜去極化達(dá)到閾電位，鈉通道打開形成動作電位。因此，鈉通道是神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)作的基礎(chǔ)。如果鈉通道被抑制，則不能形成動作電位，神經(jīng)系統(tǒng)就將處于癱瘓狀態(tài)。

3 蝎毒素與鈉離子通道的互作機(jī)制

動物毒素能夠與離子通道結(jié)合改變離子通道的開啟或關(guān)閉，從而使獵物喪失抵御捕食者的能力。通常，改變電壓門控離子通道功能的毒素通過兩種機(jī)制起作用：一種是孔區(qū)阻滯劑，它是一種小分子神經(jīng)毒素，如河豚毒素(TTX)和石房蛤毒素(STX)。它們主要通過與鈉通道的孔區(qū)結(jié)合從而堵塞孔道，直接阻止了鈉離子的通透；另一種是門控調(diào)節(jié)劑，它們通過與通道的電壓感受域(voltage-sensing domain，VSD)結(jié)合[9]，改變通道構(gòu)象，使通道開啟或失活而影響門控效應(yīng)。門控調(diào)節(jié)劑通常比孔區(qū)阻斷劑具有更高的選擇性，所以門控調(diào)節(jié)劑是研究VSD在通道激活和失活過程中復(fù)雜構(gòu)象變化的有力工具，這也是鈉通道亞型選擇性藥物開發(fā)的重要線索[10]。關(guān)于通道毒素與鈉通道互作分子機(jī)制的相關(guān)報(bào)道很多，但沒有得出它們相互作用的共識模型。早期研究表明，在門控調(diào)節(jié)劑與鈉通道結(jié)合中，細(xì)胞外S3～S4環(huán)起到主導(dǎo)作用[11]，但隨后的研究揭示S1～S2環(huán)在許多門控調(diào)節(jié)劑相互作用中的關(guān)鍵作用[12]。特別是近年研究表明，門控調(diào)節(jié)劑毒素之所以能夠影響通道的門控是因?yàn)樵摱舅亟Y(jié)合在S1～S4螺旋細(xì)胞外的空腔中，就像一個楔形物阻礙了電壓傳感器的運(yùn)動[13]。所以有人提出，大的門控調(diào)節(jié)劑毒素，如蝎毒素，可能同時(shí)結(jié)合VSD和細(xì)胞外環(huán)(連接著孔螺旋P2和孔區(qū)域中的S6區(qū)段)[14]，但迄今并沒有研究證實(shí)膜孔結(jié)構(gòu)域螺旋與門控調(diào)節(jié)劑結(jié)合中的精確機(jī)制。所以，理解和闡明毒素對電壓門控鈉離子通道調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)至關(guān)重要。

3.1鈉通道神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3

鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3主要位于鈉通道DⅣ的S1～S2胞外環(huán)和S3～S4胞外環(huán)，以及DⅠ的S5～S6的胞外環(huán)，被α-蝎毒素、?？舅睾鸵恍┲┲攵舅卣紦?jù)，能夠延緩或阻止鈉通道的失活，誘導(dǎo)鈉通道長時(shí)間開放[15，16]。α-蝎毒素是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽神經(jīng)毒素，每種都含有60到70個氨基酸殘基，通過4個二硫鍵交聯(lián)[17，18]。α-蝎毒素能夠識別哺乳動物鈉通道上的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3，通過大鼠腦鈉通道上結(jié)合位點(diǎn)3與α-蝎毒素的結(jié)合力變化研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)合力會因?yàn)橥ǖ廊O化而降低，說明α-蝎毒素與位點(diǎn)3結(jié)合的電壓依賴性與通道激活的電壓依賴性密切相關(guān)[18，19]。并且毒素對通道失活的特異性作用表明，毒素與位點(diǎn)3結(jié)合后，改變了位點(diǎn)3的構(gòu)象，阻止了通道的快速失活[20]。

通過光親和標(biāo)記、蛋白酶裂解、序列特異性抗體進(jìn)行抗體定位以及與序列特異性抗體的結(jié)合阻斷等方法對受體位點(diǎn)3的定位研究表明，α亞基DⅠ和DⅣ中的跨膜片段S5和S6之間的細(xì)胞外環(huán)參與了α-蝎毒素與位點(diǎn)3的結(jié)合。通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)說明，Nav1.2DⅣS1～S2胞外連接環(huán)上的T1560和S3～S4胞外連接環(huán)上的E1613以及S3跨膜片段上的F1610組成了Lqh2毒素與鈉通道相互結(jié)合的高親和位點(diǎn)，而在DI孔道區(qū)上的T393是Lqh2毒素的一個低親和結(jié)合位點(diǎn)[21]。鈉通道神經(jīng)毒素受體位點(diǎn)3位于DⅣ中S4的細(xì)胞外側(cè)[22]，S4段作為電壓傳感器，其序列中包含4～7個帶正電荷的氨基酸殘基，當(dāng)膜去極化時(shí)，在電場影響下向外移動，引起通道的激活[23]。α-蝎毒素通過與S4片段胞外環(huán)的氨基酸結(jié)合，阻礙了結(jié)構(gòu)域DⅣS4的運(yùn)動，這改變了通道失活所必需的構(gòu)象變化，最終延緩了通道的失活。這種毒素傳感器捕獲模型對門控修飾毒素具有廣泛的適用性[24]。利用分子模擬實(shí)驗(yàn)，推測α-蝎毒素與鈉通道相互作用的模型，在這個模型中，α-蝎毒素就像一個楔型物插入到DⅣ的S1～S2和S3～S4兩個胞外連接環(huán)之間的縫隙中與通道發(fā)生相互作用。

3.2 鈉通道神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4

鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4主要位于鈉通道DⅡ上S1～S2和S3～S4的胞外環(huán)以及DⅢ的孔道區(qū)。β-蝎毒素占據(jù)鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4，由4個二硫鍵交聯(lián)，含60到65個氨基酸殘基[25]，它通過改變鈉通道的門控特性起作用。β-蝎毒素誘導(dǎo)電壓依賴性鈉通道向超極化方向移動和鈉電流峰值的降低[26，27]。

Marcotte利用嵌合鈉通道定位受體位點(diǎn)4，分析β-蝎毒素在嵌合鈉通道上的活性。該嵌合鈉通道具有來自心臟和骨骼肌或腦鈉通道的結(jié)合域[28]。通過對通道上位點(diǎn)的突變和結(jié)構(gòu)域取代的研究，發(fā)現(xiàn)在DⅡS1～S2上突變779位點(diǎn)的Glu或在DⅡS3～S4上突變837位點(diǎn)的Glu、840位點(diǎn)的Leu和845位點(diǎn)的Gly可使Css4對rNav1.2a不敏感[29]，用來自果蠅通道DmNav1的等效結(jié)構(gòu)域替換rNav1.2a中的DⅡ可使AahIT對rNav1.2a不敏感[30]，表明DⅡ是必需的。通過研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦鈉通道受體位點(diǎn)G845N的單個氨基酸殘基突變形成的嵌合體對毒素的親和力顯著降低且通道激活的電壓依賴性沒有向超極化偏移，說明G845N可以改變β-蝎毒素的電生理效應(yīng)。因此，毒素與受體位點(diǎn)的高親和性必須依賴于被激活的受體位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。β-蝎毒素通過與S3～S4環(huán)的結(jié)合從而與激活狀態(tài)下的鈉通道DⅡS4片段的胞外末端相互作用。由于DⅡS4片段在去極化過程中向外移動，通過與DⅡS4片段胞外末端的結(jié)合，β-蝎毒素捕獲了處于外部激活位置的DⅡS4片段，并將其固定，從而使得在面對后續(xù)去極化時(shí)加強(qiáng)了通道的激活，同時(shí)，激活的電壓依賴性向超極化移動[31]。

β-蝎毒素是大分子配體，與α-蝎毒素類似，在DⅡS3～S4具有結(jié)合位點(diǎn)，與鈉通道的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可能還有額外的結(jié)合點(diǎn)[25]。這方面的第一個證據(jù)是來自于Tityuszulianus的β-蝎毒素Tz1與通道相互作用的特異性研究，其中證實(shí)位于DⅢ孔道域C末端胞外環(huán)上的3個氨基酸殘基決定了β-蝎毒素對不同亞型鈉通道的作用[32]。另一證據(jù)是顏寧組利用高分辨冷凍電鏡成像，解析了來自美洲小蠊的NavPaS鈉通道及其阻斷劑TTX/STX和其門控調(diào)節(jié)劑Dc1a的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[33]。Dc1a是一種來自沙漠灌木蜘蛛Diguetia的毒素，與β-蝎毒素相似，可以識別鈉通道受體位點(diǎn)4，是一種門控修飾劑，它們使昆蟲麻痹，對哺乳動物無毒，Dc1a可以促進(jìn)德國蟑螂電壓門控鈉通道(BgNav1)的開放，對人類鈉通道不敏感[34]。冷凍電鏡結(jié)果表明Dc1a是與美洲小蠊NavPaS鈉通道第二個VSD結(jié)合，結(jié)合后毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。由于毒素的第三與第四β折疊之間的環(huán)插入到VSD的近細(xì)胞外側(cè)，它們兩者之間形成很多氫鍵和范德華力，這些氫鍵和范德華力把VSD固定在激活狀態(tài)，激活通道。該研究得到了高分辨率的毒素-通道復(fù)合物結(jié)構(gòu)，可以清晰地看到TTX/STX與美洲小蠊的NavPaS鈉通道的結(jié)合構(gòu)象。該研究中發(fā)現(xiàn)TTX與STX在鈉通道孔區(qū)與孔區(qū)選擇性濾器域SF形成大量氫鍵，使SF堵在孔區(qū)，阻止了鈉離子通過SF[33]。實(shí)驗(yàn)表明，門控修飾劑Dc1a能夠同時(shí)結(jié)合VSD和孔道域螺旋發(fā)揮毒性，這類毒素有比先前認(rèn)知的更復(fù)雜的毒性機(jī)制。

4 展望

蝎毒素多肽與鈉通道的結(jié)合能夠改變通道的門控特性，調(diào)控機(jī)體的生理過程。雖然兩者之間的作用模式早已掌握，但由于鈉通道的復(fù)雜性，對于兩者間的精確作用機(jī)制尚不明確。隨著計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的快速發(fā)展，我們將有能力進(jìn)一步研究毒素與通道的精確作用機(jī)制，為理解蝎毒素多肽等門控修飾毒素的分子探針作用及以鈉通道為作用靶點(diǎn)的藥物研究、篩選、設(shè)計(jì)乃至開發(fā)利用提供參考。