黑曲霉胞外酶對烏龍茶中茶多酚的影響研究

李文靜，李紅，倪輝，李利君

（集美大學食品與生物工程學院福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門361021）

茶葉是我國重要的農產品[1-3]，烏龍茶是我國第3大類茶。烏龍茶因具有獨特的風味及防癌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗肥胖等[4-7]保健功效故深受消費者喜愛。

茶多酚物質是茶湯滋味中苦味、澀味的主要呈味成分，也是茶葉中最重要的活性組分。一般說來，兒茶素類物質是茶葉中最主要的茶多酚[2]，常見的8 種兒茶素是表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子酸兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素（catechin，C）、沒食子酸兒茶素（gallocatechin，GC）、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）[8-9]。Zhao 等[3]在烏龍茶中同時檢測到 6 種兒茶素：EGC、C、EGCG、EC、GCG 和ECG，其中 EGC、EGCG、EC 和 ECG 的含量較高。研究表明，這些兒茶素類物質具有多種生物活性，如中和活性自由基[10]，去除金屬離子催化[11]，調節(jié)信號分子[12]，影響凋亡調控基因的表達[13]，減輕炎癥[14]，誘導一氧化氮合成酶和環(huán)脫氫酶活性[15]，其中EGCG 被認為是兒茶素中活性最強的成分。

由于茶多酚物質是形成茶香氣和滋味品質的重要物質基礎之一，因此對茶的香氣和滋味進行改良是茶葉加工領域的熱點課題。研究表明纖維素酶類、糖苷酶類等外源酶對茶葉中茶多酚成分具有顯著影響，對于改善茶的品質具有重要意義。黑曲霉（Aspergillus niger）是常用的食品酶制劑生產菌株，安全性高，能夠分泌多種胞外蛋白酶組分。Kim 等[16]利用商品化的黑曲霉來源的纖維素酶處理綠茶渣，結果表明纖維素酶處理可以顯著提高浸提液中總茶多酚、總兒茶素和還原糖含量。Baik 等[17]采用商品化的黑曲霉來源的單寧酶和果膠酶處理綠茶葉，發(fā)現提取物中的非酯型兒茶素含量顯著上升，酯型兒茶素如EGCG 含量顯著降低，并且抗氧化活性增強；而果膠酶則通過水解綠茶多糖，使得提取物中活性多糖的含量顯著提高。

茶多酚的檢測方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[18-19]，氫譜的核磁共振法（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）[20]，近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIRS）[21]，氣相色譜質譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[22]和液相色譜質譜聯(lián)用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）等。目前應用最廣泛的方法仍是高效液相色譜法，但近年來使用LC-MS[23]或者HPLC-MS/MS[24]測定兒茶素也成為研究熱點，可以實現快速準確的定量測定兒茶素含量。

前期研究發(fā)現從烏龍茶測定的9 種兒茶素中含有多組差向異構體，如 C 和 EC、EGCG 和 GCG、ECG 和CG、GC 和ECG，這些表型和相應非表型兒茶素通過質譜圖很難區(qū)分，因此本研究首先對建立的LC-MS/MS方法進行了優(yōu)化，通過液相色譜實現了差向異構體的分離，并使用優(yōu)化后的方法對烏龍茶中兒茶素的含量變化進行分析。隨后，利用優(yōu)化后的檢測方法，分析了6 種不同培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉產生的胞外酶液處理烏龍茶后對其茶多酚組分變化影響，為直接利用微生物發(fā)酵制備的胞外酶改善茶葉品質提供了參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉菌株：購自中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心（CICC）；烏龍茶：市售；沒食子酸（GA）、沒食子酸兒茶素（GC）、表沒食子酸兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸Z 酯（CG）的純度≥98%（HPLC-DAD 檢測）：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：Sigmaaldrich。福林酚試劑、甲醇、碳酸鈉為國產分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉發(fā)酵胞外酶粗酶液的制備

分別用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、察氏液體培養(yǎng)基（察氏）、果膠液體培養(yǎng)基（果膠）、麥麩固體培養(yǎng)基（麥麩）、柚皮粉固體培養(yǎng)基（柚皮）以及茶葉梗固體培養(yǎng)基（茶葉梗）發(fā)酵黑曲霉。液體培養(yǎng)基取其發(fā)酵液；固體培養(yǎng)基，待發(fā)酵完成后，麥麩和柚皮粉固體培養(yǎng)基加入pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液，茶葉梗固體培養(yǎng)基加入pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液，20 ℃下180 r/min 振蕩浸提1 h。浸提后抽濾得粗酶液。

1.2.2 兒茶素標準儲備液的配置

分別稱取 GA、CG、EGCG、EGC、EC、GCG、C、GC 和ECG 標準品，用50%乙腈水溶液溶解，配制成1 mg/mL的儲備液。

1.2.3 樣品溶液的配置

1.2.3.1 烏龍茶樣品溶液配制

稱取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入40 mL 預熱的蒸餾水，振蕩搖勻。40 ℃水浴浸提，浸提后沸水浴5 min，再過濾，洗滌，定容至50 mL。

1.2.3.2 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶樣品溶液配制

稱取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入15 mL 預熱的黑曲霉胞外酶液和25 mL 預熱的蒸餾水，振蕩搖勻后如1.2.3.1 的方法制備。對照組如1.2.3.1 方法所示。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化

初始的色譜條件：流動相A（含有0.1%甲酸的超純水溶液）、B（含有0.1%甲酸的乙腈溶液），進樣量為5.0 μL，色譜流速 0.5 mL/min，柱溫設為 25 ℃。洗脫梯度如表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.2.4.1 色譜柱的選擇

按照初始色譜條件，分別使用3 種色譜柱：Spursil C1（8150 × 2.1 mm，3 μm，Agilent）、Zorbax SB-C1（8150 ×4.6 mm，5 μm，Agilent）和 Nucleodur PFP（250 × 4.6 mm，5 μm，Macherey-nagel），比較不同色譜柱的分離度和分析時間，選擇分離度高而分析時間短的柱子進行下一步優(yōu)化。

1.2.4.2 梯度洗脫的優(yōu)化

色譜條件同1.2.4，使用1.2.4.1 優(yōu)化得到的色譜柱，按照表2 梯度方法優(yōu)化洗脫梯度，比較不同梯度方法的分析時間，選出優(yōu)化的洗脫梯度。

1.2.4.3 柱溫條件的優(yōu)化

在 1.2.4.2 方法的基礎上，考察溫度為 25、30、35 ℃和40 ℃時色譜柱的柱溫對色譜分離度和靈敏度（信噪比）的影響，選擇柱溫條件。

表2 梯度洗脫方法Table 2 Three kinds of gradient elution methods

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系測定

取一定量的各個標準品的儲備液用乙腈水溶液稀釋成一系列濃度梯度的混合標準。茶葉中各種兒茶素的含量差別較大，因此使用不同的濃度范圍，即GA、GC、ECG 和 CG 的濃度范圍為 40 μg/L～2 000 μg/L，C 和 EC 的濃度范圍為 20 μg/L ～2 000 μg/L，EGC、EGCG 和 GCG 的濃度范圍為 20 μg/L～5 000 μg/L。根據1.2.3 優(yōu)化的色譜方法，在質譜MRM 模式下進行分析，得到標準曲線方程。

1.2.5.2 方法精密度和準確度試驗

通過日內和日間變化來評價定量方法的精密度和準確度。日內變化是在同一天測定同一個一定濃度的混合標準品溶液6 次，計算含量和誤差。日間變化是連續(xù)3 d 測定同一個混合標準品溶液，每日一次，計算含量和誤差。按照公式（1），測定含量和理論含量的比值反應準確度，標準偏差反應精密度。

1.2.5.3 回收率試驗

回收率使用標準加入法測定，選擇一個兒茶素含量較低的已知濃度的茶湯樣品，向樣品中添加一定量標準品，然后把加標后的樣品按照與樣品相同的處理方法處理后上機測定，回收率的計算見公式（2）。

1.2.6 定性定量分析烏龍茶湯中兒茶素

通過對比標準品的保留時間和質譜信息對樣品中兒茶素進行定性。樣品中兒茶素的含量通過外標法測定。

1.2.7 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的總茶多酚含量測定

總茶多酚含量的測定參考GBT8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，以各個沒食子酸工作液的吸光度值為y 軸，其相應的濃度為x 軸，制作標準曲線。

1.2.8 LC-MS/MS 測定黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量

樣品溶液測定前用0.22 μm 的有機系微孔濾膜過濾，然后稀釋100 倍進行LC-MS 分析，LC-MS 的采集方法使用優(yōu)化后的條件，兒茶素的定性和定量分析方法同1.2.6。

1.2.9 感官評價黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味

按照1.2.1 的方法將制得的黑曲霉胞外酶液進行純化。稱取1.000 g 粉碎的烏龍茶，加入1 mL 預熱的純酶液和14 mL 預熱的蒸餾水，振蕩搖勻。對照組直接加入15 mL 預熱的蒸餾水，振蕩搖勻。40 ℃水浴浸提60 min，浸提后過濾，定容至50 mL，待評價。

黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味感官評價參考文獻中方法[25]，滋味評價指標分別是：鮮味、苦味、澀味、甜味和酸味，各項指標使用10 分制（9 分= 極強烈，5 分 = 中等強度，0 分 = 極淡）。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在初始色譜條件下，分別對不同的色譜柱進行選擇，并對洗脫梯度方法以及柱溫條件進行優(yōu)化。最優(yōu)條件下分離兒茶素標準品混合溶液的總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）如圖1 所示，優(yōu)化后的色譜條件為：選用 Nucleodur PFP 色譜柱，進樣量 5.0 μL，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，梯度洗脫時間25 min。

圖1 標準品的TIC 圖Fig.1 The TIC of standard catechins

2.2 方法學考察結果

2.2.1 定量線性范圍及檢出限

利用一系列濃度的9 種標準品制作標準曲線，所得線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限如表3 所示。

由表3 可知，9 條標準曲線的相關性均≥0.998，線性關系良好。EGC、CG、EGCG 和 GCG 的檢出限和定量限最低，分別是 1 μg/L 和 4 μg/L。GA、GC、EGC、C 和EC的檢出限是 4 μg/L，其中GC、C 和 EC 的定量限是 5μg/L，而 GA 和 EGC 的定量限分別為 10 μg/L 和 25 μg/L。EGC 的檢出限和定量限最高，Zhao 等[3]和 Hu 等[26]的研究中也發(fā)現EGC 比其它兒茶素的定量限高，這可能與EGC 的化學結構有關。

表3 標準品的標準曲線方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear equation，linear range，correlation coefficient（r），limit of detection and limit of quantification of standard compounds

2.2.2 方法精密度和準確度

精密度和準確度測定結果見表4，對比日內和日間的精密度和準確度，日內的精密度和準確度一般比日間的好。9 種化合物日內的精密度≤3.72%，日間的精密度≤5.72%，日內的準確度在99.70%～104.16%之間，日間的準確度范圍96.17%～106.61%，說明方法的精密度和準確度好，可以滿足試驗要求。

2.2.3 回收率

烏龍茶湯中 GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和CG 的加標回收率見表5。

表4 標準品的精密度和準確度Table 4 Precision and accuracy of standard catechins

表5 加標回收率Table 5 Recovery of standard catechins

由表 5 可知，GA、GC、EGC、C、EC、EGCG 和 ECG的回收率良好，范圍是88.34%～107.52%。GCG 和CG的回收率較低，分別為76.05%和8.23%，造成CG 的回收率極低的原因尚不明確。所有標準品加標回收率的相對標準偏差≤3.59%。

2.3 烏龍茶湯中兒茶素含量測定

烏龍茶湯MRM 模式下TIC 圖見圖2。如圖2 所示，通過和標準品的保留時間對比，并結合質譜信息，可以確定烏龍茶湯中含有9 種兒茶素：GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 和 CG。

對烏龍茶湯中兒茶素含量見表6。

表6 烏龍茶湯中兒茶素含量測定Table 6 The contents of catechins in oolong tea infusion

由表6 可知，烏龍茶湯中占兒茶素總量最多的是EGC 和EGCG，百分比均在30%以上；其次是EC、GC、ECG 和 C，百分比均在 1%以上；而 GA、CGG 和 CG 的含量最低，百分比不足0.5%。

2.4 黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的茶多酚的含量測定

圖3 沒食子酸標準工作曲線Fig.3 The standard curve of GA

2.4.1 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的茶多酚總量測定

沒食子酸標準工作曲線見圖3，沒食子酸標準工作曲線方程為：Y=0.011 6X+0.030 4，相關系數R2=0.999 6，線性相關性良好，說明所建立的沒食子酸標準工作曲線可以滿足試驗要求。

胞外酶浸提烏龍茶湯中的茶多酚總量測定結果（已扣除酶液背景干擾）見圖4。

圖4 黑曲霉胞外酶處理烏龍茶湯的茶多酚總量Fig.4 The content of tea polyphenols in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由圖4 可知，烏龍茶提取液中茶多酚總量為1 712 mg/L，PDA 和察氏培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯中茶多酚總量無顯著變化，柚皮和茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中茶多酚總量顯著提高，增加量分別為9%和23%。Chandini 等[27]使用單寧酶液溫育紅茶葉，然后加水浸提紅茶，結果發(fā)現紅茶湯的茶多酚總量提高了14.3%。

茶葉中茶多酚包括兒茶素類、類黃酮類和黃烷醇類，它是重要的抗氧化劑，而且是茶葉中最主要的醫(yī)療活性成分[28]。因此茶多酚含量的增加，有利于增加茶葉的醫(yī)療價值。

2.4.2 LC-MS/MS 測定黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量

不同來源的黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯后對兒茶素含量的影響變化見表7。

表7 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中兒茶素含量Table 7 The contents of catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes mg/L

由表7 可知，用果膠、麥麩和茶葉梗培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的總兒茶素含量分別是 1 654.12、1 839.14、1 611.12 mg/L，明顯高于未處理過的烏龍茶湯（1 537.53 mg/L）。另一方面，使用PDA、察氏和柚皮培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中總兒茶素含量均有所下降，分別是565.44、1 278.57、1 428.70 mg/L。9 種兒茶素的含量測定結果表明（已扣除酶液背景干擾，表7），不同培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉所得胞外酶液對烏龍茶湯中兒茶素的含量和組成產生了顯著的影響（p＜0.05）。PDA 培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液使烏龍茶湯中GA 的含量顯著提高，對ECG 的含量無顯著影響，但使C 等7 種兒茶素的含量均明顯下降。察氏和柚皮培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對烏龍茶中兒茶素的溶出沒有促進作用，9 種兒茶素的含量都沒有增加。果膠培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液顯著增加了烏龍茶湯中EC、ECG和 EGCG 的含量，對 EGC、C、GA 和 GC 的含量無顯著性影響，但是GCG 和CG 的含量顯著下降。麥麩培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對提高烏龍茶湯中兒茶素含量有明顯的促進作用，9 種兒茶素含量都顯著高于未處理茶湯。用茶葉梗培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中EC、EGC 和GA 的含量顯著增加，而 C、CG、ECG、EGCG、GC 和 GCG 的含量顯著下降。

為了進一步的分析不同培養(yǎng)基發(fā)酵所得黑曲霉胞外酶液對烏龍茶湯中兒茶素含量的影響，將9 種兒茶素分成3 類，分別是酯型兒茶素類（包括CG、ECG、EGCG、GCG），非酯型兒茶素類（C、EC、EGC、GC）和GA。

圖5 黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量變化Fig.5 The contents of galloylated catechins and non-galloylated catechins in the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

由圖5 可知，麥麩和果膠培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素的含量都明顯提高，而PDA、察氏和柚皮培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型兒茶素類和非酯型兒茶素類的含量都有所下降。茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型兒茶素含量急劇下降，同時非酯型兒茶素的含量大幅上升。以上結果說明6 種黑曲霉胞外酶液對烏龍茶湯的兒茶素種類和含量都產生了顯著影響。

2.5 感官評價黑曲霉胞外酶浸提烏龍茶湯的滋味

7 名評茶員按照苦味、澀味、甜味、鮮味和酸味指標分別對6 種黑曲霉胞外酶液浸提的烏龍茶湯的滋味進行評價。黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的滋味感官評價見表8。

表8 黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的滋味感官評價表Table 8 Sensory evaluation results of the oolong tea infusions extracted by extracellular enzymes

烏龍茶湯中5 種滋味指標的強度順序為：苦味＞澀味＞鮮味＞酸味＞甜味，可見鐵觀音烏龍茶的苦澀味比較明顯。

研究表明非酯型兒茶素閾值比酯型兒茶素高，如EGC 的閾值比 EGCG 高約 2.5 倍[29-30]，所以當茶湯中酯型兒茶素含量降低時可以明顯減輕茶湯的苦味和澀味。

表8 中感官評價表明，茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液使烏龍的苦味和澀味都明顯降低，這與LC-MS/MS 測定的茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量變化結果一致；用麥麩培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液浸提烏龍茶湯的澀味顯著增強，這與茶湯中酯型兒茶素的含量增加有關。圖5表明PDA 培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素含量都明顯降低，因而感官結果顯示PDA培養(yǎng)基所得酶液使烏龍茶湯的苦味顯著降低。綜上可知，感官評價結果中苦味和澀味的強度變化與烏龍茶湯中酯型兒茶素的含量變化基本一致。此外，茶葉梗培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液處理使得烏龍茶湯的酸味明顯增強，察氏、果膠和柚皮培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液處理對烏龍茶湯的滋味沒有顯著影響。鮮味和甜味的方差分析結果表明6 種培養(yǎng)基所得黑曲霉胞外酶液對烏龍茶湯的鮮味和甜味沒有明顯的改變作用。

3 結論

本文通過優(yōu)化后的LC-MS/MS 方法測定烏龍茶湯中茶多酚組分變化，并對烏龍茶湯進行感官評價，研究了6 種培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉所得胞外酶液對烏龍茶湯中茶多酚的影響。優(yōu)化后的LC-MS/MS 方法相比UHPLC-UV[31]以及NIRS[32]等方法更為簡單且分離度高，分離時間更短。黑曲霉是酶制劑生產菌株，根據不同的誘導基質能夠分泌不同的胞外蛋白酶組分。用6 種不同的基質誘導黑曲霉發(fā)酵，對茶多酚的組分變化產生了不同的影響。結果表明，茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中茶多酚總量顯著提高，同時烏龍茶湯中非酯型兒茶素的含量也大幅提高，而酯型兒茶素含量有所降低。果膠、麥麩培養(yǎng)基所得酶液浸提烏龍茶湯的總兒茶素明顯高于參考烏龍茶湯，烏龍茶湯中酯型和非酯型兒茶素的含量也有所提高。PDA、察氏、柚皮培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中不僅總兒茶素含量降低，并且酯型兒茶素類和非酯型兒茶素類的含量也降低。

不同培養(yǎng)基發(fā)酵引起茶多酚的組分變化，進而影響其風味。感官評價結果表明，6 種黑曲霉胞外酶液對烏龍茶湯的鮮味和甜味無顯著性影響。PDA 和茶葉梗培養(yǎng)基所得酶液使烏龍茶湯的苦澀味明顯降低，麥麩培養(yǎng)基所得酶液浸提的烏龍茶湯中澀味顯著增強，這與烏龍茶湯中酯型兒茶素的含量變化有關。