基于響應(yīng)面法對蜂糧液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

張娟，王順喜，李丹，羅美玲，夏曉華，張坤，段傳人，*

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400030；2.重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司，重慶404508）

蜂糧又叫蜂面包、蜂巢花粉，是蜜蜂將采集的花粉咬碎夯實加上蜂蜜之后，在微生物作用下所形成的自然發(fā)酵產(chǎn)物。蜂糧不僅是幼蜂的主要營養(yǎng)來源，更是整個蜂群繁衍生息的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，蜂糧還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂類、黃酮類化合物、生物活性物質(zhì)等，因此對人體也具有良好的營養(yǎng)保健作用[1-3]。

在對蜂產(chǎn)品的研究中，相對于蜂蜜、蜂膠、蜂王漿，蜂糧的研究較少，但蜂糧作為一類新型的高級營養(yǎng)保健品所具有的營養(yǎng)價值優(yōu)勢逐漸成為共識。楊文超[3]等在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗對油菜花粉的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的蜂糧適口性有很大改善，營養(yǎng)價值也得到了提高。朱奇[4]等在研究中發(fā)現(xiàn)，利用從天然蜂糧分離出的有益菌株，對蜂花粉進行人工發(fā)酵，再加入雙歧因子和蜂膠制成的復(fù)合制品的抑瘤率可以達到67.6%?？梢姺浼Z的保健效果逐漸被發(fā)現(xiàn)，因此，人工發(fā)酵蜂糧具有良好的前景[5-7]。

優(yōu)良菌株不僅是發(fā)酵制品得到良好風(fēng)味的基礎(chǔ)，也是發(fā)酵制品質(zhì)地以及產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)，更是保證產(chǎn)品標準化的核心。乳酸菌的作用著重于改善食品的風(fēng)味，提高產(chǎn)品的保藏性和附加值，此外它還有很多特殊的健康功效，比如改善消化系統(tǒng)功能、抑制腫瘤、降低膽固醇含量、增強抵抗力等[4，7-10]。

響應(yīng)面分析（response surface methods，RSM）是一種基于數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)的結(jié)合，將體系的響應(yīng)作為一個或多個因素的函數(shù)，然后將這種函數(shù)關(guān)系用圖形顯示出來，從而使得試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件得到確定的方法。本文在單因素試驗法的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進行分析，得出人工發(fā)酵蜂糧的最優(yōu)條件，以期為人工蜂糧的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[11-15]。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 培養(yǎng)基

MRS 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 mL，酵母粉4 g/L，瓊脂粉15 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L 磷酸氫二鉀 2 g/L，硫酸錳 0.05 g/L，pH 6.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：以松花粉作為液態(tài)發(fā)酵的主要培養(yǎng)基，為了一定程度地保護花粉的活性成分，90 ℃滅菌30 min，備用。

1.1.2 發(fā)酵菌種的選定

通過對天然蜂糧中微生物的分離與鑒定，對分離出的3 株植物乳桿菌進行產(chǎn)酸活性和抑菌活性的測定，確定出產(chǎn)酸能力和抑菌活性最好的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為發(fā)酵菌株。

1.1.3 設(shè)備

超凈工作臺（SW-CJ-1BU/18U 型）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱（SHP-250 型）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS 型）：上海申安醫(yī)療器械廠；搖床（THZ-C 型）：北京寅韜興業(yè)科技有限公司；發(fā)酵罐（30L-7000c）：上海保興生物設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺內(nèi)挑取1 環(huán)～2 環(huán)保藏在斜面上的植物乳桿菌，將其接種于MRS 平板上，置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。然后挑取2 環(huán)～3 環(huán)已活化的菌株到30 mLMRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，制成濃度約為106個/mL 的菌懸液[16]。

1.2.2 乳酸菌活菌數(shù)測定

稱取5.0 g 發(fā)酵好的蜂糧倒入三角瓶（裝有適量玻璃珠）中，然后加入15 mL 蒸餾水進行振蕩，使樣品被研磨成均勻的稀釋液。梯度稀釋法再次進行稀釋，稀釋梯度分別為 10-1、10-2、10-3……10-9，在超凈工作臺內(nèi)每個梯度吸取100 μL 樣品到MRS 固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d 后選擇蜂糧含菌量大概在10 cfu/cm2的梯度平板為適宜濃度，兩個平板為一個濃度，結(jié)果取平均值[17]。

1.2.3 蜂糧感官評定

1.2.3.1 感官評定評價標準

評價指標主要考慮發(fā)酵蜂糧產(chǎn)品的顏色、香氣和口感3 個方面，每項指標滿分5 分，請5 名專業(yè)的食品評判員對這3 個指標進行評分，分別考慮各指標的權(quán)重系數(shù)后得到最終評分。具體評價標準如表1 所示。

表1 蜂糧感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria for bee food

1.2.3.2 感官評定指標權(quán)重

為了把握單個指標在總評價中的相對水平，請8名從事食品檢測和評價的工作人員對以上3 個感官評價因素進行打分，從而確定蜂糧感官評價時各因素的權(quán)重。8 名工作人員對蜂糧3 個感官因素的評價結(jié)果見表2。

綜合表1 和表2，經(jīng)過計算，蜂糧的顏色、香氣、口感的權(quán)重系數(shù)分別為0.29、0.27、0.44。設(shè)蜂糧顏色評分為X，香味評分為Y，口味評分為Z，則蜂糧綜合感官評分公式為：蜂糧綜合感官評分=0.29X+0.27Y+0.44Z。

表2 感官評定的指標權(quán)重Table 2 The index weight of sensory evaluation

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵單因素試驗

1.2.4.1 料液比對發(fā)酵的影響

稱取花粉1 500 g，分別在料液比為0.07、0.09、0.11、0.13 g/mL 和0.15 g/mL 條件下進行發(fā)酵，乳酸菌接種量為9%，發(fā)酵溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，當(dāng)發(fā)酵內(nèi)上的pH 值連續(xù)2 d 變化小于0.05 時停止發(fā)酵，測量料液比對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)和感官評定指標的影響。

1.2.4.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵的影響

稱取花粉1 500 g，取料液比為0.11 g/mL，分別加入3%、6%、9%、12%、15%的乳酸菌菌懸液，設(shè)置發(fā)酵溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min 條件下進行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)的pH 值連續(xù)2 d 變化小于0.05 時停止發(fā)酵，測量乳酸菌接種量對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)和蜂糧感官評定指標的影響。

1.2.4.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

稱取花粉1 500 g，取料液比為0.11 g/mL，設(shè)置乳酸菌接種量為9%，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為400 r/min，發(fā)酵溫度分別設(shè)定為 29、31、33、35、37 ℃進行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)的pH 值連續(xù)2 d 變化小于0.05 時停止發(fā)酵，測量發(fā)酵溫度對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)和感官評定指標的影響。

1.2.4.4 攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

稱取花粉1 500 g，取料液比為0.11 g/mL，設(shè)置乳酸菌接種量為9%，設(shè)置發(fā)酵溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為 300、350、400、450、500 r/min 進行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)的pH 值連續(xù)2 d 變化小于0.05 時停止發(fā)酵，測量攪拌轉(zhuǎn)速對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)和感官評定指標的影響[18-20]。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗Box-Behnken 設(shè)計試驗因素與水平，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 3 Factors and levels in the RSM

以乳酸菌活菌數(shù)以及感官評定為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken Design 方法設(shè)計試驗，用Design Expert8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，確定蜂糧人工發(fā)酵的最優(yōu)條件[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對發(fā)酵結(jié)果的影響

稱取1 500 g 花粉，分別在料液比為0.07、0.09、0.11、0.13 g/mL 和0.15 g/mL 條件下進行發(fā)酵，乳酸菌接種量均為為9%，發(fā)酵溫度均為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速均為400 r/min，在不同料液比的條件下發(fā)酵，比較料液比對人工蜂糧蜂糧活菌數(shù)和感官評定的影響。乳酸菌活菌數(shù)與料液比的關(guān)系見圖1，料液比對蜂糧感官評定的影響見圖2。

圖1 料液比對蜂糧活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of feed liquid ratio on the number of viable bacteria in bee bread

圖2 料液比對蜂糧感官評定的影響Fig.2 The effect of feed liquid ratio on sensory evaluation of bee bread

由圖1 可知，隨著料液比的增大，蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)也在增大，料液比為0.13 g/mL，活菌數(shù)目達到最大值（1.82×107cfu/g）。觀察圖 2 可知，當(dāng)料液比為0.13 g/mL 時，蜂糧的感官評分最高（3.85 分）。因此，確定蜂糧發(fā)酵的較適料液比為0.13 g/mL。

2.2 乳酸菌接種量對發(fā)酵的影響

選擇料液比為0.11 g/mL，發(fā)酵溫度33 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min 條件下，測定不同乳酸菌接種量對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)以及感官評定的影響，結(jié)果分別見圖3和圖4。

圖3 乳酸菌接種量對蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.3 The effect of lactobacillus inoculation amount on the number of live lactobacillus in bee bead

圖4 乳酸菌接種量對蜂糧感官評定的影響Fig.4 Effects of lactobacillus inoculation amount on sensory evaluation of bee bread

由圖3 可知，隨著乳酸菌接種量的增大，乳酸菌的活菌數(shù)也呈上升趨勢；由圖4 可知，乳酸菌接種量小于9%時，蜂糧的感官評分較低，但當(dāng)乳酸菌接種量超過9 %時，發(fā)酵加劇，感官評分也有所降低。綜合考慮，選定乳酸菌接種量9 %為蜂糧發(fā)酵的乳酸菌較適接種量。

2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

選擇料液比為0.11 g/mL，乳酸菌接種量為9%，轉(zhuǎn)速為400 r/min，對比不同發(fā)酵溫度對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)和感官評定的影響，見圖5 和圖6。

圖5 發(fā)酵溫度對蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Fermentation temperature on the effect of lactic acid bacteria number of living bacterium in the bee bread

圖6 發(fā)酵溫度對蜂糧感官評定的影響Fig.6 Fermentation temperature on the sensory evaluation the effect of bee bread

由圖5 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，人工蜂糧中乳酸菌的活菌數(shù)呈上升趨勢，在33 ℃之后趨于平穩(wěn)；由圖6 可知，發(fā)酵溫度低于33 ℃時，發(fā)酵不完全，人工蜂糧感官評分較低，超過33 ℃時溫度過高，蜂糧色澤變深，口感也變澀，感官評分降低，綜合比較，33 ℃時蜂糧和活菌數(shù)和感官評定都較好，因此確定人工蜂糧發(fā)酵的較適溫度為33 ℃。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

選擇料液比為0.11 g/mL，乳酸菌接種量為9%，發(fā)酵溫度為33 ℃，研究不同攪拌轉(zhuǎn)速對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)以及感官評定的影響。結(jié)果見圖7 和圖8。

圖7 攪拌轉(zhuǎn)速對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.7 Effect of stirring speed on the number of viable lactic acid bacteria

觀察圖7 可知，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增大，蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)也呈增大的趨勢，根據(jù)圖8 可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速低于400 r/min 時，人工蜂糧的感官評分較低，而當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速超過400 r/min 時，人工蜂糧發(fā)酵加劇，口感評分降低，綜合圖7 和圖8，確定400 r/min 為人工蜂糧發(fā)酵的較適發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速。

圖8 攪拌轉(zhuǎn)速對蜂糧感官評定的影響Fig.8 Influence of stirring speed on sensory evaluation of bee bread

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Design Expert8.0.6的Box-Behnken 設(shè)計原理，對蜂糧的人工發(fā)酵條件進行了四因素三水平試驗，所得試驗結(jié)果如表4 所示。

表4 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 4 Experimental scheme and results of response surface

以乳酸菌活菌數(shù)以及感官評定為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design 設(shè)計得到的試驗結(jié)果，利用Design Expert8.0.6 的軟件對表4 數(shù)據(jù)進行分析，得到乳酸菌活菌數(shù)（107cfu/g，以 Y1表示）與感官評分（Y2）對自變量裝液量（A）、乳酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和攪拌轉(zhuǎn)速（D）的多元回歸方程：

Y1=1.96+0.1A-0.022B+0.082C+0.27D+0.20AB+0.28AC-0.093AD-0.22BC+0.15BD-0.46A2-0.47B2-0.20C2-0.18D2

Y2=4.38+0.13A-0.012B+1.667×10-3C+0.085D-0.13AB+0.070AC-0.055AD+0.068BC+0.033BD+0.068CD-0.28A2-0.18B2-0.16C2-0.061D2

對回歸模型進行可信度分析和方差分析，結(jié)果如表 5、表 6 所示。

表5 方差分析結(jié)果（以乳酸菌活菌數(shù)為響應(yīng)值）Table 5 Results of variance analysis（taking the number of live bacteria of lactic acid bacteria as the response value）

表6 方差分析結(jié)果（以感官評分為響應(yīng)值）Table 6 Results of variance analysis（response value of sensory score）

續(xù)表6 方差分析結(jié)果（以感官評分為響應(yīng)值）Continue table 6 Results of variance analysis（response value of sensory score）

由表5 和表6 可知，兩個模型的F 值分別為74.06和220.94，且P 值都小于0.000 1，說明這兩個模型的回歸方程是極顯著的。失擬項都不顯著，說明這兩個模型的模擬性都較好，模型1 中的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.984 7，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2adj=0.971 4，預(yù)測負相關(guān)系數(shù)R2Pred=0.924 6，表明修正復(fù)相關(guān)系數(shù)0.971 4 與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)0.924 6 有著很好的相符度。模型2 中復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2adj=0.991 0，預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Pred=0.975 9，同樣，修正復(fù)相關(guān)系數(shù)0.991 0 與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)0.975 9 也有著很好的相符度。這說明兩個模型都有較好的回歸性。模型1 的信噪比為27.825，模型2 的信噪比為52.526，信噪比＞4就說明該模型具有足夠的信號來響應(yīng)設(shè)計。因此，這兩種模型分別可以對蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)以及蜂糧的感官評定進行分析和預(yù)測[22]。

據(jù)表5 和表6 分析，模型1 中B 項無顯著影響，其他項均對乳酸菌活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05），其中A、C 和 D 等一次項，AB、AC、BC、BD 等交互項和 A2、B2、C2、D2等二次項對乳酸菌活菌數(shù)的影響極顯著（P＜0.01）。模型2 中的C 項無顯著影響，其他項均對感官評分有顯著影響（P＜0.05），其中 A 和 D 等一次項，AB、AC、AD、BC、CD 等交互項和 A2、B2、C2、D2等二次項對感官評分的影響極顯著（P＜0.01）。

F 值的大小反映出因素對試驗指標的影響程度，F(xiàn)值越大表示因素對試驗指標的影響越顯著。由表8 可知，對蜂糧中乳酸菌活菌數(shù)的影響大小的因素依次是：因素D＞因素A＞因素C＞因素B（攪拌轉(zhuǎn)速＞料液比＞發(fā)酵溫度＞乳酸菌接種量）。通過表9 可知，對蜂糧感官評分影響大小的因素順序是：因素A＞因素D＞因素B＞因素C（料液比＞攪拌轉(zhuǎn)速＞乳酸菌接種量＞發(fā)酵溫度）。

為了探究兩兩因素的交互作用對蜂糧發(fā)酵的影響，根據(jù)表5 和表6 中的試驗結(jié)果用軟件生成三維圖，見圖9 和圖10。

圖9 兩兩因素對乳酸菌活菌數(shù)影響的曲面圖Fig.9 Surface diagram of the effect of two factors on the number of viable lactobacillus

圖10 兩兩因素對蜂糧感官評定的影響Fig.10 Effects of two factors on sensory evaluation of bee bread

對其進行響應(yīng)面模擬分析，制作AB、AC、BD、CD之間的響應(yīng)曲面圖，根據(jù)曲面形狀，分析料液比、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速對蜂糧液態(tài)發(fā)酵中乳酸菌活菌數(shù)和蜂糧感官評分的影響，從而找到蜂糧發(fā)酵的最佳因素[23-25]。

由圖9 可知，料液比和乳酸菌接種量的交互作用對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)的影響較大，而乳酸菌接種量和發(fā)酵溫度的交互作用對人工蜂糧乳酸菌活菌數(shù)的影響較小。

由圖10 可知，料液比和乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度的交互作用都對人工蜂糧感官評分的影響非常顯著。

利用Design-Expert8.0.6 軟件聯(lián)合求解這兩個模型，得出最佳料液比為0.13 g/mL、乳酸菌接種量為9.67%、發(fā)酵溫度33.17 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速445.40 r/min。為驗證結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)再次進行蜂糧液態(tài)發(fā)酵，為滿足實際操作，將料液比調(diào)整為0.13 g/mL、乳酸菌接種量調(diào)整為10%、發(fā)酵溫度調(diào)整為33 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整為445 r/min。得到的蜂糧平均乳酸菌活菌數(shù)為2.107×107cfu/g，平均感官評分為4.42，和模型預(yù)測的乳酸菌活菌數(shù)2.060 91×107cfu/g，感官評分4.408 2相差較小，因此確定人工蜂糧液態(tài)發(fā)酵的最佳參數(shù)為料液比為0.13 g/mL，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為445 r/min。

3 結(jié)論

以乳酸菌活菌數(shù)和感官評分對蜂糧人工發(fā)酵參數(shù)進行了響應(yīng)面分析，得到液態(tài)小型中試發(fā)酵罐（30 L）發(fā)酵蜂糧的最佳參數(shù)為料液比為0.13 g/mL，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵溫度為33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為445 r/min，在此條件下人工蜂糧的平均乳酸菌活菌數(shù)為2.107×107cfu/g，平均感官評分為4.42 分。