不同乳糖酶酶學(xué)特性比較及在無乳糖原料奶生產(chǎn)中的應(yīng)用

程凱麗，胡志和*，張秋月，季 鈺，王 帥，吳偉捷，趙旭飛，賈凌云

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳糖是以單體分子形式存在于乳中的唯一雙糖，經(jīng)乳腺內(nèi)乳糖合成酶作用產(chǎn)生[1]。乳糖攝入后需要乳糖酶將其分解成單糖后才可以被吸收。由于腸道缺少乳糖酶，常引發(fā)乳糖不耐受。其最常見的癥狀為腹瀉，如不引起重視可導(dǎo)致營養(yǎng)不良、貧血、骨質(zhì)疏松等疾病[2-3]。

降低牛奶中乳糖的方法主要有物理法（主要是膜分離技術(shù)）[4]、生物法（酶法和微生物發(fā)酵法）[5-8]、基因工程法[9]。利用乳糖酶水解降低乳中乳糖含量是常用的方法。乳糖酶在動(dòng)植物和微生物中分布廣泛，微生物來源主要有大腸桿菌、乳酸桿菌、酵母菌和霉菌等，多數(shù)乳糖酶都采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)[10-12]。源于微生物的乳糖酶，研究較多的是米曲霉和克魯維酵母[13-14]。岳壽松等[15]對(duì)馬克斯克魯維酵母菌所產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為47 ℃和7.0；侯重文等[16]對(duì)重組米曲霉乳糖酶和原米曲霉乳糖酶酶學(xué)性對(duì)照，證明重組酶與對(duì)照酶的最適反應(yīng)溫度相同，雖然pH穩(wěn)定性相差不大，但重組酶的熱穩(wěn)定要明顯優(yōu)于對(duì)照酶。

牛乳營養(yǎng)豐富，含有多種生物活性成分，是人類天然的保健食品[17]。同時(shí)，牛乳中的各種活性成分為不同類型功能性食品的開發(fā)提供了極好的天然原料來源[18]。但受乳糖不耐的影響，牛乳資源的利用受到限制。開發(fā)低乳糖或無乳糖的乳制品，對(duì)解決乳糖不耐受群體對(duì)乳的消費(fèi)，以及開拓乳品市場非常必要。本研究對(duì)不同微生物來源的乳糖酶的水解特性進(jìn)行研究，并應(yīng)用于無乳糖原料奶制備，以期為無乳糖乳制品生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳和乳糖酶A、B、C 天津海河乳業(yè)有限公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenol β-D-galactoside，ONPG） 北京Biotopped科學(xué)技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-5100紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Bayer LactoMonitor乳糖檢測儀 美國拜安捷公司；VELP旋渦振蕩器 德祥科技有限公司；DK-420型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Heracles II電子鼻 法國Alpha M.O.S公司；ME2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS-PAGE檢測乳糖酶成分及分子質(zhì)量

選擇十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）的方法檢測不同乳糖酶成分及分子質(zhì)量，選用濃縮膠和分離膠分別為5%和12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色。

1.3.2 乳糖酶等電點(diǎn)的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[19]測定乳糖酶等電點(diǎn)。具體方法為：將3 種不同的乳糖酶分別稱取11等份置于50 mL離心管中，加入適量的去離子水；然后分別將粗酶液pH值調(diào)至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，4 000 r/min離心20 min，分別取0.6 mL樣品上清液于試管中，加入5.0 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液及0.4 mL去離子水，混合后靜置3 min。取上清液在595 nm波長處測吸光度。

1.3.3 乳糖酶活力的測定

采用ONPG法測定乳糖酶活力，中性乳糖酶活力參照文獻(xiàn)[20]中的方法進(jìn)行測定；酸性乳糖酶活力測定參照文獻(xiàn)[21]方法，并做適當(dāng)調(diào)整。

樣品的制備：稱量適量樣品，精確至毫克，用反應(yīng)緩沖液溶解后，轉(zhuǎn)移至合適容量瓶中并定容，使得最后的溶液中含有0.027～0.095 U的酶活力。取0.5 mL稀釋后的實(shí)驗(yàn)液，在42 ℃水浴10 min，加入已預(yù)熱至42 ℃的ONPG溶液2 mL，42 ℃水浴15 min后，快速加入2.5 mL 10% Na2CO3溶液，并渦旋管以停止酶反應(yīng)。反向添加ONPG底物和Na2CO3溶液作為空白，其余步驟與樣品相同。30 min內(nèi)，在420 nm波長處檢測樣品和空白液的吸光度。

1.3.4 不同條件對(duì)乳糖酶活力的影響

1.3.4.1 溫度對(duì)乳糖酶活力的影響

分別在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃的反應(yīng)溫度下測定乳糖酶活力。酶活力測定過程中每個(gè)測試樣各取3 份做平行檢測，取平均值（以下實(shí)驗(yàn)平行處理方式相同）。

1.3.4.2 pH值對(duì)乳糖酶活力的影響

在同一溫度下，按1.3.3節(jié)酶活力測定方法，測定pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0條件下酶活力。

1.3.5 不同溫度下儲(chǔ)存原料奶揮發(fā)性成分分析

為確定酶解時(shí)間，分別將原料奶儲(chǔ)存在于4、6、8 ℃和10 ℃環(huán)境中，每小時(shí)取1 次樣，精確稱取7.0 g樣品，放入10 mL的頂空瓶中，加蓋密封后在Heracles II超快速氣相色譜電子鼻上進(jìn)行測定分析，采用AlphaSoft V 14.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Heracles II電子鼻系統(tǒng)采用兩根并行不同極性的金屬毛細(xì)管色譜柱MXT-5和MXT-1701，升溫速率10 ℃/s，使用雙氫火焰離子化檢測器。采用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（n C6～n C16）進(jìn)行校準(zhǔn)，將保留時(shí)間轉(zhuǎn)化為保留指數(shù)，然后通過Aro Chem Base數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物進(jìn)行定性分析。

實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下，頂空進(jìn)樣參數(shù)：加熱器孵化期20 min，孵化溫度50 ℃；進(jìn)樣量5 000 μL，進(jìn)樣口溫度200 ℃，注射時(shí)間45 s。捕集阱參數(shù)：捕集溫度40 ℃，分流10 mL/min，捕集時(shí)間50 s，最終溫度240 ℃。柱溫參數(shù)：初始溫度50 ℃，以1 ℃/s速率升溫至80 ℃，然后以3 ℃/s速率升溫至250 ℃；數(shù)據(jù)采集時(shí)間110 s。檢測器參數(shù)：檢測器溫度260 ℃。

1.3.6 無乳糖原料奶制備條件

1.3.6.1 低溫下加酶量對(duì)乳糖殘留量的影響

根據(jù)原料儲(chǔ)存溫度，水解溫度分別設(shè)置為4、6、8、10 ℃，酶A、B和C加酶量分別為2 000、3 000、4 000、5 000 U/kg和6 000 U/kg，分別于不同時(shí)間取樣測乳糖殘留量。

1.3.6.2 原料奶中乳糖殘留量的檢測

使用乳糖檢測儀，根據(jù)原料奶中含有的葡萄糖以及乳糖的含量計(jì)算出液態(tài)奶中乳糖殘留量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值，用Origin 95c作圖，用電子鼻自帶軟件Alpha Soft V14.2進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖酶酶學(xué)特性比較

2.1.1 乳糖酶SDS-PAGE分析

3 種乳糖酶的SDS-PAGE結(jié)果見圖1。經(jīng)計(jì)算，乳糖酶B和C的分子質(zhì)量約為130 kDa；乳糖酶A的分子質(zhì)量分別約為38 kDa和55 kDa。因此，乳糖酶A含有兩種成分。

圖1 乳糖酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE profiles of lactases derived from different sources

2.1.2 乳糖酶的等電點(diǎn)分析

將乳糖酶溶液調(diào)整至不同pH值、離心，取上清液，檢測其溶解情況，進(jìn)而確定其等電點(diǎn)。由圖2可知，乳糖酶A有兩個(gè)等電點(diǎn)，分別為4.0和5.0，這與電泳結(jié)果（圖1）相符；乳糖酶B等電點(diǎn)為5.0；乳糖酶C等電點(diǎn)為3.0。雖然乳糖酶B和C的電泳結(jié)果（圖1）顯示具有相同的分子質(zhì)量，但其等電點(diǎn)不同，因此，乳糖酶B和C是不同來源的乳糖酶。

圖2 pH值對(duì)乳糖酶溶解性能的影響Fig. 2 Effects of pH on lactase solubility

2.1.3 乳糖酶活力測定

2.1.3.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線及3 種酶活力檢測

將不同濃度的ONP溶液在波長420 nm處測定吸光度，以O(shè)NP濃度為橫坐標(biāo)，以波長420 nm處吸光度為縱坐標(biāo)制作ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得擬合方程：Y=4.576 8X＋0.007 3，R2=0.999。按照酶活力定義[20-21]為一個(gè)中性乳糖酶單位（U）定義為在實(shí)驗(yàn)條件下以1.30 μmol/min的速率釋放鄰硝基苯酚的酶量；一個(gè)酸性乳糖酶單位（U）定義為在測定條件下以1 μmol/min的速率釋放鄰硝基苯酚的酶量。計(jì)算乳糖酶A、B和C的酶活力分別為6 341、9 469、15 039 U/g。

2.1.3.2 溫度對(duì)乳糖酶活力的影響

圖3 溫度對(duì)酶活力的影響Fig. 3 Effect of temperature on lactase activity

如圖3所示，酶A、酶B和酶C最適反應(yīng)溫度分別為40、35 ℃和45 ℃，因?yàn)闇囟仁怯绊懨富钚缘闹饕蛩刂唬ǔＧ闆r下各種酶都會(huì)有其最適作用溫度，在此溫度下酶的活力最高。如果溫度太高會(huì)影響酶蛋白的次級(jí)鍵，使蛋白質(zhì)變性，降低其酶活性；溫度過低，不利于酶的反應(yīng)進(jìn)程[22]。因此，溫度過高或過低，酶活都有一定程度的降低。廠家提供數(shù)據(jù)顯示酶A最適溫度為37～40 ℃，酶B和酶C最適溫度為38～40 ℃。因此，測定結(jié)果與廠家提供略有差異。

2.1.3.3 pH值對(duì)乳糖酶活力的影響

在不同pH值條件下，檢測乳糖酶活力，其活力變化見圖4。酶A和酶B趨勢基本一致，在pH 6.5時(shí)到達(dá)最高值；而酶C在pH 5.0時(shí)酶活性最高。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，酶活力隨著pH值的增大而逐漸增強(qiáng)；但當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，酶活力開始呈下降趨勢。由于pH值對(duì)乳糖酶的活性有重要影響，在一定的pH值范圍內(nèi)，酶表現(xiàn)出較高的活性，pH值過高或過低都會(huì)影響酶的構(gòu)象，從而影響酶與底物的結(jié)合能力，導(dǎo)致酶活降低[23]。廠家提供酶A、酶B和酶C最適pH值分別為6.5、6.5和5.0，研究結(jié)果均與3 個(gè)廠家提供信息一致；酶A和B為中性乳糖酶，酶C為酸性乳糖酶。因此，通過電泳、等電點(diǎn)分析，以及不同溫度和pH值下酶活力的變化，3 種酶的性質(zhì)不同，可能來自不同的微生物。根據(jù)3 種乳糖酶的性質(zhì)不同，在制備無乳糖原料奶過程中，可采用中性乳糖酶A和B。

圖4 pH值對(duì)乳糖酶活力的影響Fig. 4 Effect of pH on lactase activity

2.2 低溫儲(chǔ)存對(duì)原料奶氣味的影響

采用電子鼻對(duì)儲(chǔ)存期間原料奶氣味變化進(jìn)行分析，確定不同溫度下儲(chǔ)存時(shí)間，進(jìn)而為不同溫度下乳糖酶水解乳糖，制備無乳糖原料奶提供時(shí)間參數(shù)。

2.2.1 不同溫度儲(chǔ)存原料奶的主成分分析

根據(jù)Alpha MOS電子鼻數(shù)據(jù)分析規(guī)則，若主成分分析累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到95%以上，且識(shí)別指數(shù)大于80，即可證明樣品間具有顯著性差異。由圖5可知，4、6、8 ℃和10 ℃主成分分析，其主成分1和2的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為60.274%、57.393%、53.852%、64.448%，均未達(dá)到80%；且識(shí)別指數(shù)分別為-172、-36、-178和-162，均未達(dá)到80，說明在4、6、8 ℃和10 ℃儲(chǔ)存12 h無法區(qū)別原料奶中氣味成分的變化，因此，在4～10 ℃范圍內(nèi)，原料奶儲(chǔ)存12 h無顯著變化。

圖5 不同儲(chǔ)存溫度下的原料奶主成分分析Fig. 5 Principal component analysis of raw milk stored at different temperatures for different durations

2.2.2 不同溫度儲(chǔ)存原料奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

利用電子鼻對(duì)原料奶在4、6、8 ℃和10 ℃條件下儲(chǔ)存不同時(shí)間產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，表1～4顯示，原料奶主要揮發(fā)性物質(zhì)包括：丙酮、2,3-丁二酮、2-丁酮、乙醛、月桂酸甲酯、甲硫醇、1-十九碳烯、1-壬烯-3-酮、二甲基硫醚、1-辛烯、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙?；?2-噻唑啉、乙酸等，在檢出的化合物中，酮類物質(zhì)最豐富。本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果與韓清波等[24]報(bào)道結(jié)果一致。各物質(zhì)間共同作用構(gòu)成原料奶的揮發(fā)性風(fēng)味，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，各類揮發(fā)性物質(zhì)比例發(fā)生變化，乙酸、2,3-丁二酮、2-丁酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、吲哚出現(xiàn)下降趨勢，但整體無顯著性差異。乙酸具有淡淡的酸味[25]，是牛奶中的主要揮發(fā)性成分之一，不同溫度下儲(chǔ)存比例略有變化，但變化幅度不大；酮類物質(zhì)多由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解或微生物代謝產(chǎn)生，由于溫度較低，微生物代謝受抑制。因此，酮類略下降，但無顯著性差異[26-28]。丙酮、2-壬酮、乙醛、月桂酸甲酯、甲硫醇、1-十九碳烯總體呈現(xiàn)上升趨勢，整體也無顯著性差異。醇類化合物主要來自脂肪氧化和氨基酸分解，有文獻(xiàn)報(bào)道飽和醇的風(fēng)味閾值較高，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，不飽和醇的風(fēng)味閾值較低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[29]；2-壬酮具有果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，微生物可分解原料奶中的糖類，在各種酶參與下經(jīng)過一系列催化反應(yīng)，可生成醛類，醛類又可進(jìn)一步生成醇類，酸與醇發(fā)生反應(yīng)生成酯類。因此，月桂酸甲酯出現(xiàn)小幅度增長；含硫氨基酸主要是指半胱氨酸和蛋氨酸，硫醇來自牛乳中含硫氨基酸的分解[30-31]，是一種具有明顯風(fēng)味的揮發(fā)性含硫化合物。儲(chǔ)存過程中二甲基硫無明顯變化，較為平穩(wěn)，二甲基硫化物是新鮮牛奶的重要香氣成分[32]，微量的二甲基硫是牛奶風(fēng)味的主體，且在儲(chǔ)存的每一個(gè)階段均可檢出，但未能找到其風(fēng)味閾值，故未能對(duì)原料奶儲(chǔ)存過程中風(fēng)味貢獻(xiàn)大小進(jìn)行評(píng)價(jià)[33]。

表1 4 ℃儲(chǔ)藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 4 ℃

表2 6 ℃儲(chǔ)藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 6 ℃

表3 8 ℃儲(chǔ)藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 8 ℃

續(xù)表3

表4 10 ℃儲(chǔ)藏條件下原料奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Analysis of volatile flavor compounds in raw milk stored at 10 ℃

2.3 低溫下乳糖酶添加量對(duì)原料奶中乳糖水解效果的影響

乳糖水解率是衡量乳糖水解程度的一個(gè)重要指標(biāo)[34]，根據(jù)2.2.1節(jié)的檢測結(jié)果，低溫下儲(chǔ)存12 h，原料奶氣味無顯著性差異。不同量的乳糖酶A對(duì)乳糖水解結(jié)果如圖6所示，原料奶乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%，在4 ℃條件下，當(dāng)酶添加量為2 000 U/kg時(shí)，乳糖水解速率較慢，水解12 h，乳糖殘留量仍不到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)（即乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%），隨著溫度的升高，相同加酶量下，乳糖水解效率提高，8 ℃和10 ℃分別在11 h和10 h降到0.5%以下；當(dāng)酶添加量為3 000 U/kg時(shí)，不同儲(chǔ)存溫度，均可在12 h內(nèi)達(dá)到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，隨著加酶量的增加，水解效率明顯加快，10 ℃加酶量為6 000 U/kg時(shí)，3 h即可水解到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)水平。伍桃英等[35]研究證明，加酶量相同，乳糖水解率與水解時(shí)間呈正相關(guān)；相同溫度下，乳糖水解率隨著加酶量的增加而增大。

在實(shí)際生產(chǎn)中，原料奶的儲(chǔ)存溫度在4～8 ℃之間，儲(chǔ)存時(shí)間一般在5～6 h之間。在此時(shí)間內(nèi)，4 ℃和6 ℃條件下，酶A添加量為6 000 U/kg；在8 ℃和10 ℃條件下，酶A添加量為4 000 U/kg，其乳糖含量即可降至無乳糖牛奶的水平。

圖6 添加不同量的乳糖酶A對(duì)原料奶中乳糖殘留量的影響Fig. 6 Effect of adding different amounts of lactase A on lactose residue in raw milk

在4～10 ℃添加不同量乳糖酶B，乳糖水解效果見圖7。乳糖殘留量降低趨勢與圖6基本相同。與酶A相比，酶B的水解效率較低，在4、6 ℃和8 ℃條件下，2 000 U/kg的加酶量乳糖均未在12 h內(nèi)降至無乳糖牛奶水平；在10 ℃條件下，11 h時(shí)乳糖殘留量才能夠降至0.49%，達(dá)到無乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，溫度越高，乳糖水解速度越快。低溫下，0～1 h乳糖殘留量降低幅度很大，1 h后降低速率減慢，這可能是隨水解時(shí)間的延長，乳糖水解成葡萄糖的量增加，導(dǎo)致水解效率下降[36]，馮永強(qiáng)等[37]研究無乳糖酸乳的制備時(shí)證實(shí)了乳糖酶的添加量對(duì)乳糖殘留影響較大。因在實(shí)際生產(chǎn)中原料奶儲(chǔ)存時(shí)間一般在5～6 h之間，8 ℃和10 ℃儲(chǔ)存時(shí)均可選擇5 000 U/kg和6 000 U/kg的乳糖酶添加量。

圖7 添加不同量的乳糖酶B對(duì)原料奶中乳糖殘留量的影響Fig. 7 Effect of adding different amounts of enzyme B on lactose residue in raw milk

3 結(jié) 論

經(jīng)檢測，3 種乳糖酶中，酶A和酶B為中性乳糖酶（酶活力的最適pH值為6.5），酶C為酸性乳糖酶（酶活力的最適pH值為5.0），且3 種乳糖酶來自不同微生物。在無乳糖原料奶生產(chǎn)中，應(yīng)用中性乳糖酶A和酶B較好。電子鼻結(jié)果表明，原料奶低溫儲(chǔ)存12 h風(fēng)味上無顯著性差異；在該時(shí)間范圍內(nèi)，4～8 ℃條件下，原料奶中添加乳糖酶A或酶B，添加量6 000 U/kg，可將原料奶乳糖含量降至無乳糖水平（小于0.5%），且能夠保證原料奶質(zhì)量；另外，乳糖酶A的降解原料奶中乳糖的效率更好。