地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶I型 的克隆表達(dá)及其在降低薯條中丙烯酰胺的應(yīng)用

陳菊花，焦琳舒，謝亞娟，陸兆新，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

L-天冬酰胺酶（EC.3.5.1.1）可將L-天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺基水解成天冬氨酸和氨，是一種氨基水解酶類。L-天冬酰胺酶可用于臨床治療急性淋巴細(xì)胞白血病，霍奇金淋巴瘤和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤等多種疾病[1-2]，受到了國內(nèi)外的高度關(guān)注。此外，L-天冬酰胺酶可有效降低熱加工食品中潛在致癌物丙烯酰胺質(zhì)量濃度，在食品加工領(lǐng)域中也顯示出巨大的應(yīng)用價值。丙烯酰胺具有潛在的神經(jīng)毒性、遺傳毒性以及致癌性，高淀粉類食品經(jīng)高溫油炸、烘焙或燒烤后都會產(chǎn)生丙烯酰胺[3-4]。L-天冬酰胺是丙烯酰胺形成的重要的前體物質(zhì)，L-天冬酰胺和還原糖在高于120 ℃的溫度下發(fā)生美拉德反應(yīng)生成丙烯酰胺[5-6]。而經(jīng)L-天冬酰胺酶處理后，食品原材料中的游離L-天冬酰胺被水解，可從源頭上抑制食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生。目前，僅有丹麥諾維信公司生產(chǎn)的來源于米曲霉的Acrylaway?和荷蘭帝斯曼公司生產(chǎn)的黑曲霉來源的Prevent ASeTM商品酶，實現(xiàn)了在食品加工中的應(yīng)用[7]。而國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究還相對薄弱，尚未有自主創(chuàng)新的商品化L-天冬酰胺酶制劑。因此，根據(jù)工業(yè)酶的需求出發(fā)，開發(fā)產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、催化效率高的新型L-天冬酰胺酶制劑，從源頭上控制熱加工食品中丙烯酰胺形成具有十分重要的意義。

L-天冬酰胺酶來源廣泛，從微生物（細(xì)菌、霉菌、酵母、放線菌和藻類），到高等生物（植物、脊椎動物和動物組織）均發(fā)現(xiàn)有L-天冬酰胺酶的存在[8]，如豚鼠[9]、睡茄[10]、微藻[11]、歐文氏菌[12]、釀酒酵母[13]等。根據(jù)其序列及結(jié)構(gòu)同源性的差異，L-天冬酰胺酶可被分為兩種不同的類型：I型和II型。I型酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，通常具有較低的底物親和力，無抗腫瘤活性，僅應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域；II型酶存在于細(xì)胞周質(zhì)中[14]，底物親和力普遍較高，可應(yīng)用于食品加工與醫(yī)藥領(lǐng)域[15-16]。近年來，L-天冬酰胺酶的應(yīng)用研究多集中于II型酶，枯草芽孢桿菌[17]、巨大芽孢桿菌[18]、巴倫氏類芽孢桿菌[19]等多種不同來源的L-天冬酰胺酶II型皆被證實了具有抑制高熱加工食品中丙烯酰胺生成的能力，而有關(guān)I型酶的應(yīng)用研究相對較少，有關(guān)于地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶I型的應(yīng)用研究鮮見報道。

本實驗室在前期研究中篩選到一株具有L-天冬酰胺酶活力的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis Z-1，菌種保藏號：CGMCC NO:17310）。為了提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的表達(dá)量，降低其純化難度，將地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶I型酶基因克隆，并實現(xiàn)了其在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)，進(jìn)行了重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。同時，探究了其在油炸土豆中的丙烯酰胺降解能力，為I型酶在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-天冬酰胺酶產(chǎn)生菌株B. licheniformis Z-1、克隆宿主Escherichia coli DH5α和表達(dá)L21(DE3)均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室保藏。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

限制性內(nèi)切酶Nde I與Xho I、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T連接試劑盒 大連寶生物（TaKaRa）公司；pET-30a(＋)表達(dá)載體 德國Novagen公司；柱式質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marker 南京諾唯贊生物科技有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（分子級）、Tris生工生物工程（上海）股份有限公司；基因組Bacterial DNA kit試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC-100TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國MJ Research公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；58410R冷凍高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；JY92-2D超聲波破碎儀、SB5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝科學(xué)儀器研究所；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；Pow PacTM高電流電泳儀 美國Bio-Rad有限公司；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、6410Triple Quad LC/MS質(zhì)譜儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆和序列分析

參照GenBank中公布的B. licheniformis的全基因組序列（CP005965.1），利用primer premier 5.0軟件設(shè)計編碼天冬酰胺酶ansA基因的引物序列，即含有Nde I酶切位點（下劃線）上游引物BlAase I-F：5’-CCGCATATGATGA AAAAGAAAGTAGCTCTTATTACAACA-3’，含有Xho I酶切位點（下劃線）下游引物BlAase I-R：5’-CCGCTCG AGGTAGCAGAATTTGTCTTTTATGCCTT-3’。用Omega Bio-Tek公司基因組DNA提取試劑盒抽提B. licheniformis Z-1的基因組DNA，以其為模板擴(kuò)增ansA片段。將PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆宿主E. coli DH5α。對菌液PCR驗證正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶增菌和抽提質(zhì)粒，隨后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.2 重組菌株E. coli BL21(DE3)/pET-30a(＋)-BlAase I的構(gòu)建和表達(dá)

用Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶對上述重組質(zhì)粒PMD19-T-BlAase I和表達(dá)載體pET-30a(＋)分別進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。通過T4 DNA連接酶將目的基因ansA片段與pET-30a(＋)載體片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化克隆宿主E. coli DH5α。將PCR驗證結(jié)果正確的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(＋)-BlAase I。重組質(zhì)粒pET-30a(＋)-BlAase I和空載質(zhì)粒pET-30a(＋)分別轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)。挑取單克隆接種至30 mL LB（50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，以此為種子液。以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的100 mL LB（50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)約至OD600nm為0.6～0.8時，立即加入IPTG至終質(zhì)量濃度100 μg/mL，180 r/min、16 ℃條件下誘導(dǎo)16 h。以重組菌E. coli BL21(DE3)/pET-30a(＋)作為對照。

1.3.3 重組酶的分離純化

4 ℃、8 000×g離心5 min收集菌體，將菌體充分重懸于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中，之后采用超聲波破碎儀處理重懸液（破碎參數(shù)40 W，工作1 s、停2 s，共超聲15 min）。破碎液于4 ℃、12 000×g離心30 min，所得上清液即為L-天冬酰胺酶粗酶液。因目標(biāo)蛋白N端融合了His組氨酸標(biāo)簽，故可通過鎳柱親和層析對重組L-天冬酰胺酶進(jìn)行純化。對粗酶和純化后的重組L-天冬酰胺酶進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，采用Bradford法[20]測定蛋白濃度。

1.3.4 酶活性測定

通過參考N e s s l e r試劑法[21]測定酶活性。將189 mmol/L L-天冬酰胺底物溶液100 μL和粗酶液100 μL加入700 μL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，混勻后于37 ℃水浴反應(yīng)20 min，加100 μL 25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液終止反應(yīng)?；旌衔?2 000 r/min離心1 min。取40 μL上清液和100 μL Nessler加入860 μL超純水中，顯色10 min，測定436 nm波長處吸光度?？瞻讓φ战M則先加入TCA終止反應(yīng)，然后進(jìn)行水浴處理。酶活性單位定義：在pH 8.0和37 ℃的反應(yīng)條件下，每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol氨所需要的酶量被定義為1 個酶活力單位。

1.3.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.5.1 重組酶的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

將酶溶液分別置于pH 6.0～11.0緩沖液中，于37 ℃測定酶活性以確定最佳反應(yīng)pH值。將酶溶液在4 ℃的pH 6.0～11.0的緩沖液中儲存12 h，以處理0 h酶活性為100%，測定相對酶活力，研究重組酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.2 重組酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

將酶液置于25～60 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定酶活性確定最適反應(yīng)溫度。將酶液分別置于4、40、45、50、60 ℃孵育12 h，間隔1 h取樣，以處理0 min酶活性作為100%，于最適pH值和最適溫度條件下測定相對酶活力，研究重組酶的溫度穩(wěn)定性。

1.3.5.3 金屬離子對重組酶活性的影響

在酶活性測定體系中添加終濃度為1 mmol/L的不同金屬離子（K＋、Na＋、Zn2＋、Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Fe2＋、Cu2＋、Fe3＋），以無添加金屬離子所測酶活性為100%，測定相對酶活力。

1.3.5.4 重組酶的酶促動力學(xué)性質(zhì)

以200 mmol/L的L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸分別作為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，研究純化的重組L-天冬酰胺酶的底物專一性。以6～18 mmol/L L-天冬酰胺為底物，在最適反應(yīng)條件下測量酶活性。酶活性測定方法與L-天冬酰胺酶活性測定方法一致。采用Lineweaver-Burk法作圖，得到米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

1.3.6 重組酶在薯條中的應(yīng)用

1.3.6.1 薯條制作工藝流程

參考Franco等[22]方法。將土豆洗凈并去皮，切成長條形（5 mm×5 mm×70 mm），在自來水下漂洗1 min去除表面的淀粉。將樣品分離成4 份，預(yù)處理如下：1）浸泡在超純水中，40 ℃放置30 min；2）浸泡于5 IU/mL重組L-天冬酰胺酶溶液中，40 ℃放置30 min；3）浸泡于20 IU/mL重組L-天冬酰胺酶溶液中，40 ℃放置30 min；4）浸泡于30 IU/mL重組L-天冬酰胺酶溶液中，40 ℃放置30 min。將浸泡后的土豆條瀝干后置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，60 ℃干燥10 min。將每個處理組的土豆條分別于175 ℃預(yù)炸1 min后置于-20 ℃冷凍48 h，175 ℃油炸5 min后瀝油冷卻干燥。

1.3.6.2 土豆中游離L-天冬酰胺和L-天冬氨酸的提取及檢測

參考趙巖等[23]方法，略作修改。將油炸前干燥后的土豆條粉碎，稱取5 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液50 mL，超聲30 min，抽濾，將濾液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)溶劑，用0.1 mol/L HCl溶液定容至5 mL，過0.45 μm濾膜，上樣檢測。

對土豆中游離的L-天冬酰胺和L-天冬氨酸進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，色譜柱C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。檢測參數(shù)：流動相甲醇-0.05 mol/L乙酸銨（2∶98，V/V），等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL；電噴霧電離源正離子模式；L-天冬酰胺檢測離子m/z 74.2、87.1；L-天冬氨酸檢測離子m/z 88.1、116.1。

1.3.6.3 薯條中丙烯酰胺的提取及檢測

參考程江華等[24]提供的方法，略作修改。10 g均質(zhì)后的薯條（粉碎、烘干），加入40 mL正己烷脫脂，重復(fù)3 次。加入50 mL去離子水、50 mL乙腈、20 g MgSO4和5 g NaCl，振蕩2 min，超聲水浴30 min，10 000×g離心10 min，取乙腈層（上層）于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將乙腈旋干，加1 mL超純水復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測。

H P L C參數(shù)：A g i l e n t H C-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（10∶90，V/V），等度洗脫；流速0.5 mL/min；柱溫31 ℃；波長210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶基因擴(kuò)增和序列分析

以B. licheniformisZ-1基因組DNA為模板，擴(kuò)增ansA基因如圖1所示，目的條帶長度在1 000 bp左右，測序結(jié)果顯示該基因序列為972 bp，編碼324 個氨基酸，證明B. licheniformisZ-1L-天冬酰胺酶ansA基因已克隆成功，命名為BlAase I型。為了分析不同微生物來源的L-天冬酰胺酶的親緣關(guān)系，將BlAase I型和目前已發(fā)表的5 種L-天冬酰胺酶I型繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。進(jìn)化樹顯示BlAase I型與古菌Pyrococcus furiosus和Pyrococcus horikoshii來源的L-天冬酰胺酶I型在進(jìn)化關(guān)系上更為相近。

圖1 B. licheniformis Z-1中ansA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR-ampli fied ansA gene from B. licheniformisZ-1

圖2 不同來源L-天冬酰胺酶I型的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenic tree of L-asparaginases type I from various bacterial sources

2.2 重組L-天冬酰胺酶的表達(dá)與純化

重組酶粗酶活為（63.64±3.18） IU/mL，通過Ni柱純化后，重組酶比活力為945.79 IU/mg，純化倍數(shù)為21.70 倍，回收率為71.4%（表1）。對重組酶進(jìn)行SDSPAGE電泳驗證，結(jié)果表明，目的蛋白在35 kDa左右有單一條帶（圖3），與理論值36.6 kDa相符合。

表1 酶的分離純化步驟Table 1 Summary of enzyme purification steps

圖3 SDS-PAGE檢測Fig. 3 SDS-PAGE of crude and purified enzyme

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 重組酶的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

將重組酶置于37 ℃、pH 6.0～11.0的條件下進(jìn)行酶活力測定。結(jié)果如圖4A所示，重組酶的最適反應(yīng)pH 10.0。將重組酶在pH 6.0～11.0的緩沖液中4 ℃條件下儲存12 h后，測定重組酶相對酶活力。其pH值穩(wěn)定性結(jié)果如圖4B所示，重組酶pH值穩(wěn)定性較好，在pH 6.0～11.0范圍內(nèi)儲存12 h仍保留60%以上的活性。此重組酶具有一個相對較寬的pH值活性范圍，在堿性的環(huán)境中都表現(xiàn)出良好的催化活性。

圖4 pH值對重組酶活力的影響Fig. 4 Effect of pH on the recombinant enzyme activity

2.3.2 重組酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

將重組酶置于pH 8.0，溫度范圍為25～60 ℃條件下進(jìn)行酶活力測定。結(jié)果如圖5A所示，重組酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃。將重組酶置于不同溫度下，每隔一段時間取樣，在最適反應(yīng)pH值及最適反應(yīng)溫度下測定酶活力。結(jié)果如圖5B所示，該重組酶在低溫（4 ℃）條件下保存穩(wěn)定，12 h后相對酶活力僅下降3.79%。當(dāng)在較高溫度（40 ℃和45 ℃）處理12 h后，相對酶活力仍高于90%。當(dāng)溫度高于45 ℃時，酶的熱穩(wěn)定性顯著降低，在50 ℃存放10 h后相對酶活下降至30.62%，在60 ℃存放8 h后相對酶活力僅為3.87%。

圖5 溫度對重組酶活力的影響Fig. 5 Effect of temperature on the recombinant enzyme activity

2.3.3 金屬離子對重組酶活力的影響

研究終濃度為1 mmol/L的不同金屬離子對重組酶活力的影響，結(jié)果見表2。其中，Mn2＋、Mg2＋和K＋對重組酶具有顯著激活作用，Mn2＋的作用效果最強(qiáng)；而Zn2＋對重組L-天冬酰胺酶有抑制作用，使其相對酶活力降低至（82.95±1.23）%；其余各金屬離子對酶活力無顯著影響。

表2 金屬離子對重組酶活力的影響Table 2 Effect of metal ions on the recombinant enzyme activity

2.3.4 重組酶底物特異性與動力學(xué)研究

測定重組酶對不同底物的作用效果，結(jié)果如圖6所示。該重組酶能水解L-天冬酰胺和D-天冬酰胺，但對D-天冬酰胺的活性僅為L-天冬酰胺的23.38%，對L-谷氨酰胺等其他4 種底物均無活性。

圖6 重組酶的底物特異性Fig. 6 Substrate specificity of the recombinant enzyme

使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，計算重組酶對底物L(fēng)-天冬酰胺的Km和Vmax，結(jié)果見圖7，米氏常數(shù)Km為12.19 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為2.69 IU/mL。

圖7 重組酶動力學(xué)常數(shù)Lineweaver-Burk圖Fig. 7 Lineweaver-Burk plot for determining the kinetic parameters of the recombinant enzyme

2.4 重組酶處理對薯條中丙烯酰胺含量的影響

圖8 酶濃度對L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及丙烯酰胺含量的影響Fig. 8 Effect of L-asparaginase concentration on the contents of L-asparagine, L-aspartic acid and acrylamide of French fries

比較不同酶的濃度對油炸前土豆條中的L-天冬酰胺、L-天冬氨酸含量以及油炸后薯條中丙烯酰胺質(zhì)量濃度的影響，結(jié)果如圖8所示。L-天冬酰胺作為丙烯酰胺的重要前體物質(zhì)，隨著酶濃度的增加，土豆條中的L-天冬酰胺轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，從而導(dǎo)致最終薯條中丙烯酰胺含量逐步降低。未經(jīng)酶處理的土豆條中（對照組）丙烯酰胺含量為5.780 μg/g，將土豆條置于5 IU/mL和20 IU/mL的酶液中浸泡30 min后，丙烯酰胺含量分別降低31.96%和40.87%，置于30 IU/mL的酶液中浸泡30 min后，丙烯酰胺含量進(jìn)一步降低，降幅達(dá)58.39%。隨著重組酶添加濃度的升高，薯條中丙烯酰胺含量逐漸降低。

3 討 論

本研究中將地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶I型酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，測定了重組酶酶學(xué)性質(zhì)以及對油炸土豆中丙烯酰胺的抑制效果。將BlAase I型氨基酸序列與不同來源L-天冬酰胺酶I型進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，BlAase I型與已知結(jié)構(gòu)的其他I型酶差異較大，與之同源性最高的是激烈火球菌I型酶[25]（P. furiosus，PDB ID：4NJE），同源性僅為30%；其次是大腸桿菌I型酶[26]（PDB ID：2HIM），同源性為27%。

作為一種新型的L-天冬酰胺酶I型，BlAase I型具有出色的催化能力，重組酶活力可達(dá)（63.64±3.18）IU/mL，高于多種其他來源的L-天冬酰胺酶，如阿爾巴諾卡氏菌（Nocardiopsis alba，18.47 IU/mL）[27]和棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans，4.3 U/mL）[28]等。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，BlAase I型的最適反應(yīng)pH值為10.0，相較于大多數(shù)L-天冬酰胺酶偏堿性[28]。在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)儲存12 h后，BlAase I型仍保留80%以上的活性。此外，大部分的L-天冬酰胺酶來源于嗜溫微生物，其最適反應(yīng)溫度在30～45 ℃之間[21,29]，BlAase I型的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，同樣符合這一特點。BlAase I型熱穩(wěn)定性較好，在45 ℃處理12 h后相對酶活力仍大于90%。這些特性使其可耐受食品加工過程中各種苛刻的pH值及穩(wěn)定環(huán)境，在食品加工領(lǐng)域中具有廣闊應(yīng)用前景。另外，Mn2＋對重組酶具有較強(qiáng)的激活作用，這與來源于米黑根毛霉的L-天冬酰胺酶情況相似[30]。在底物特異性方面，多數(shù)L-天冬酰胺酶通常無法催化D-天冬酰胺，對谷氨酰胺有部分活性，如熒光假單胞菌[31]和釀酒酵母[13]等來源的L-天冬酰胺酶。而BlAase I型對L-天冬酰胺的特異性強(qiáng)，無谷氨酰胺酶活性，具有較弱的D-天冬酰胺催化活性。

BlAase I型可有效抑制薯條中丙烯酰胺的產(chǎn)生，在30 IU/mL的酶液中處理0.5 h后，丙烯酰胺降解率最高可達(dá)58.39%。然而，經(jīng)枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶處理后，土豆中的丙烯酰胺質(zhì)量濃度降解了90%～95%[32]，經(jīng)巨大芽孢桿菌L-天冬酰胺酶處理后，土豆中的丙烯酰胺降解率為92.4%[18]，即與其他文獻(xiàn)報道中的L-天冬酰胺酶II型相比，BlAase I型對油炸土豆中丙烯酰胺的降解效果仍有差距。究其原因，BlAase I型的Km值較高，底物的親和力較差，在30 min內(nèi)結(jié)合及水解土豆中L-天冬酰胺的效率較低。針對BlAase I型底物親和力不強(qiáng)的問題，基于該酶現(xiàn)有的生物學(xué)特性，分析可能影響底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點，利用定點突變和迭代飽和突變技術(shù)對其進(jìn)行分子改造，獲得底物親和力顯著提高的突變酶，從而提高該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。