不同產(chǎn)地牡丹皮規(guī)格等級內(nèi)涵研究

袁寶金　高貫彪　張洪坤　吳韶輝　路麗　黃玉瑤　潘林燕

摘要 [目的]建立同時測定牡丹皮中7種指標(biāo)性成分含量的方法，綜合多成分指標(biāo)含量分析不同產(chǎn)地牡丹皮等級的內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系，探討牡丹皮規(guī)格等級內(nèi)涵。[方法]采用高效液相色譜（HPLC）法測定不同產(chǎn)地不同規(guī)格等級牡丹皮樣品中7種指標(biāo)性成分的含量，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長為230 nm;流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃。[結(jié)果]建立的HPLC方法中的沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚分別在0.004～0.055、0.013～0.189、0.003～0.045、0.019～0.291、0.002～0.030、0.005～0.076、0.050～0.752 μg線性關(guān)系良好;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率分別為102.93%、96.12%、99.19%、92.69%、97.49%、103.96%、99.71%。[結(jié)論]建立的HPLC法操作簡單、精確，可用于同時測定不同規(guī)格等級牡丹皮中7種指標(biāo)性成分的含量。不同產(chǎn)地不同規(guī)格等級牡丹皮與有效成分含量之間規(guī)律不盡相同，其中銅陵、蕪湖和亳州產(chǎn)地牡丹皮等級與有效成分含量之間呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān)，即隨著等級升高含量降低，其他產(chǎn)地牡丹皮等級與含量之間無統(tǒng)一趨勢的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 牡丹皮;規(guī)格等級;高效液相色譜法;含量測定;指標(biāo)性成分

中圖分類號 R284文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0179-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Connotation of Specification Grade of Cortex Moutan in Different Producing Areas

YUAN Baojin1，2，GAO Guanbiao1，ZHANG Hongkun1，2 et al

（1.Bozhou Huqiao Pharmaceutical Co.，Ltd.，Bozhou，Anhui 236800;2.Guangzhou Zhongzhiyuan Chinese Medicine Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510925）

Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for simultaneously determining the content of seven index components in cortex moutan.The content of multicomponent indicators was used to analyze the intrinsic quality relationship of cortex moutan grades from different producing areas，and the connotation of specification grade of cortex moutan was discussed.[Method]High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the content of seven kinds of index components in different grades of cortex moutan samples from different areas.The column was Agilent ZORBAX SBC18 （5 μm，250 mm×4.6 mm） with a detection wavelength of 230 nm;the phase was acetonitrile0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at a flow rate of 1 mL/min，an injection volume of 10 μL，and a column temperature of 30 ℃.[Result]The linear relationships of gallic acid，oxypaeoniflorin，catechin，paeoniflorin，benzoic acid，benzoyl paeoniflorin and paeonol were good in the range of 0.004-0.055，0.013-0.189，0.003-0.045，0.019-0.291，0.002-0.030，0.005-0.076，0.050-0.752 μg.The RSD of precision，stability and repeatability tests were less than 3%.The recovery rates of the samples were 102.93%，96.12%，99.19%，92.69%，97.49%，103.96% and 99.71%，respectively.[Conclusion]The established HPLC method is simple and accurate，and can be used to simultaneously determine the content of seven index components in different specifications of cortex moutan.There are different rules for the content of cortex moutan and active ingredients in different grades of different producing areas.There is a weak negative correlation between the level of cortex moutan and the content of active ingredients in Tongling，Wuhu and Bozhou，that is，the content decreases with the increase of grade，there is no correlation between the grade and content of the moutan cortex in other producing areas.

Key words Cortex moutan;Specification grade;HPLC;Content determination;Index components

基金項目 國家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目（ZYBZH-Y-AH-03）。

作者簡介 袁寶金（1989—），女，湖南永州人，藥士，從事中藥研發(fā)及其質(zhì)量評價研究。通信作者，主管藥師，碩士，從事中藥研發(fā)及其質(zhì)量評價研究。

收稿日期 2019-06-10

牡丹的藥用價值自先秦開始體現(xiàn)，明確記載“牡丹”始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]，之后更多古書典籍[2-6]中提及牡丹的藥用，入藥部位為牡丹的根皮。《中國藥典》（2015版）一部記載，牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，秋季采挖根部，除去細(xì)根和泥沙，剝?nèi)「?，曬干或刮去粗皮，除去木心，曬干。前者?xí)稱連丹皮，后者習(xí)稱刮丹皮?？?、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、癰腫瘡毒[7]。

中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)藥效、檢驗、純度、美觀的統(tǒng)一，中藥材功效主要是藥效，因此傳統(tǒng)藥效應(yīng)是中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)先指標(biāo)[8]。以產(chǎn)地、性狀指標(biāo)劃分的規(guī)格實質(zhì)上是藥效強弱與功效的差異，因此應(yīng)積極開展藥效與成分的相關(guān)性研究。張雨鳳等[9]對牡丹皮藥材規(guī)格等級進行初探，研究發(fā)現(xiàn)在不同等級中，四等牡丹皮中芍藥苷含量最高，一等牡丹皮中丹皮酚含量最高，芍藥苷含量在主根中最少，在支根中最多，芍藥苷和丹皮酚積累量的趨勢相反。李靜[10]采用聚類分析法和主成分分析法分析，綜合評價牡丹皮藥材和飲片的規(guī)格等級、價格與被測指標(biāo)的相關(guān)性;通過相關(guān)性分析，市售亳州牡丹皮的價格與5種指標(biāo)的含量基本不呈正相關(guān);大小、性狀、顏色等外在因素決定了牡丹皮市場價位及規(guī)格等級。筆者通過建立同時測定牡丹皮中7種指標(biāo)性成分含量的方法，綜合多成分指標(biāo)含量分析不同產(chǎn)地牡丹皮等級的內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系，探討牡丹皮規(guī)格等級內(nèi)涵，為牡丹皮藥材規(guī)格等級的劃分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

牡丹皮分別為產(chǎn)地收集的連丹皮和刮丹皮以及產(chǎn)自安徽亳州十河鎮(zhèn)牡丹皮基地的刮丹皮。收集5個產(chǎn)地連丹皮，分別產(chǎn)自安徽省銅陵市銅陵縣順安鎮(zhèn)、安徽蕪湖市南陵縣何灣鎮(zhèn)、四川省達州市通川區(qū)、山西省運城市絳縣、湖南邵陽邵東縣;收集4個產(chǎn)地刮丹皮，分別產(chǎn)自安徽亳州十河鎮(zhèn)牡丹皮基地、安徽亳州時譙城區(qū)華佗鎮(zhèn)、湖北恩施利川市、重慶市墊江縣。根據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)及前期研究結(jié)果，將牡丹皮劃分為4個等級，分別為一等（編號1），長度≥5.0 cm，中部直徑≥1.0 cm;二等（編號2），長度≥5.0 cm，中部直徑1.0 cm>D≥0.8 cm;三等（編號3），長度≥5.0 cm，中部直徑0.8 cm>D≥0.5 cm;統(tǒng)貨（編號4），不分大小。

1.1.2 儀器。

高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）;MX5電子天平（百萬分之一，Mettler Toledo）;XS204電子天平（萬分之一，Mettler Toledo）;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海市一恒科學(xué)儀器有限公司）;DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD檢測器）;ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（美國Agilent公司）。

1.1.3 試劑。

沒食子酸（110831-201605，中國食品藥品檢定研究院，純度90.8%）;兒茶素（110877-201604，中國食品藥品檢定研究院，純度99.2%）;氧化芍藥苷（MUST-16021505，成都曼斯特有限公司，純度99.93%）;芍藥苷（110736-201539，中國食品藥品檢定研究院，純度96.4%）;苯甲酸（100419-200301，中國食品藥品檢定研究院）;丹皮酚（110708-201407，中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%）;苯甲酰芍藥苷（MUST-16061803，成都曼斯特有限公司，純度99.28%）;甲醇為色譜純（Merck）;磷酸為色譜純（阿拉?。?甲醇分析純（廣州化學(xué)試劑廠）;超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）;以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫;柱溫為30 ℃;檢測波長為230 nm。理論板數(shù)按丹皮酚峰計算應(yīng)不低于10 000。

1.2.2 對照品溶液的制備。分別取沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，得質(zhì)量濃度分別為0.5、0.5、0.3、1.0、0.5、1.0、0.5 mg/mL的單個對照品溶液。分別精密移取上述各對照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.003 6、0.003 0、0.012 6、0.019 4、0.002 0、0.050 1、0.005 1 mg/mL的混合對照品溶液。

47卷21期 袁寶金等 不同產(chǎn)地牡丹皮規(guī)格等級內(nèi)涵研究

1.2.3 供試品溶液的制備。取本品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4 線性關(guān)系考察。分別精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液1、3、5、7、10、15 μL，在“1.2.1”色譜條件下進樣檢測分析，記錄峰面積，以各待測物進樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸。

1.2.5 精密度試驗。精密吸取牡丹皮同一混合對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件，重復(fù)進樣6次，分別記錄各成分峰面積，計算各成分含量的RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗。按“1.2.3”方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、24 h進樣檢測，分別記錄各成分峰面積，計算各成分含量的RSD。

1.2.7 重復(fù)性試驗。取同一批藥材，按“1.2.3”方法平行制備供試品溶液6份，按“1.2.1”色譜條件進樣分析，分別記錄各成分峰面積，計算各成分含量的RSD。

1.2.8 加樣回收試驗。精密稱取本品粉末6份，每份0.25 g，分別精密添加沒食子酸0.304 8 mg、氧化芍藥苷1.133 0 mg、兒茶素0.145 4 mg、芍藥苷1.998 0 mg、苯甲酸0.140 0 mg、苯甲酰芍藥苷0.471 1 mg、丹皮酚5.594 0 mg，按照“1.2.3”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件進行測定，計算加樣回收率。

1.2.9 含量測定。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 對照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同出峰時間中均有相應(yīng)的峰出現(xiàn)，且該條件下樣品中的目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度較大，說明此條件適合測定牡丹皮各成分的含量。

2.1.2 線性關(guān)系的考察。以各待測物進樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，具體結(jié)果見表2，結(jié)果表明，各成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗。按照“1.2.5”方法操作，結(jié)果得出牡丹皮中沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.50%、0.23%、0.79%、0.37%、0.36%、0.47%和0.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.6”方法操作，結(jié)果得出牡丹皮中沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.66%、1.66%、1.34%、0.68%、1.57%、0.86%和0.42%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗。按照“1.2.7”方法操作，結(jié)果得出牡丹皮中沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚的含量分別為0.138%、0.065%、0.511%、0.901%、0.062%、0.212%和2.523%，RSD分別為1.20%、2.23%、2.89%、0.96%、2.22%、0.50%和1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗。按照“1.2.8”方法操作，計算加樣回收率，結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚的平均加樣回收率分別為102.93%、96.12%、99.19%、92.69%、97.49%、103.96%、99.71%，RSD分別為1.69%、2.15%、3.34%、0.78%、1.45%、2.44%、0.69%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.2 各指標(biāo)成分含量測定結(jié)果

各成分的方法確定并驗證后，取不同產(chǎn)地不同規(guī)格等級的牡丹皮樣品，進行各指標(biāo)含量測定，結(jié)果見圖2～8。結(jié)果表明，7種成分中，沒食子酸、氧化芍藥苷的含量與等級無明顯相關(guān)性;安徽蕪湖和四川達州的兒茶素含量與等級呈弱的正相關(guān)性，湖北恩施的兒茶素含量與等級呈弱的負(fù)相關(guān)性，其他產(chǎn)地的兒茶素含量與等級無明顯相關(guān)性;安徽銅陵和安徽蕪湖的芍藥苷含量與等級呈弱的負(fù)相關(guān)性，其他產(chǎn)地的芍藥苷含量與等級無明顯相關(guān)性;湖南邵陽的苯甲酸含量與等級呈弱的負(fù)相關(guān)性，其他產(chǎn)地的苯甲酸含量與等級無明顯相關(guān)性;安徽蕪湖的苯甲酰芍藥苷含量與等級呈弱的負(fù)相關(guān)性，其他產(chǎn)地的苯甲酰芍藥苷含量與等級無明顯相關(guān)性;安徽蕪湖和安徽基地的丹皮酚含量與等級呈弱的負(fù)相關(guān)性，山西運城的丹皮酚含量與等級呈弱的正相關(guān)性，其他產(chǎn)地的丹皮酚含量與等級無明顯相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

比較不同產(chǎn)地不同等級的牡丹皮7種成分的含量，整體上看不同產(chǎn)地不同規(guī)格等級牡丹皮與有效成分含量之間規(guī)律不盡相同，大部分成分的含量隨等級變化趨勢并不明顯，其中銅陵、蕪湖和亳州產(chǎn)地牡丹皮等級與有效成分含量之間呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān)，即隨著等級升高含量降低，其他產(chǎn)地牡丹皮等級與含量之間無統(tǒng)一趨勢的相關(guān)性。目前藥材市場對牡丹皮藥材的等級劃分主要是依據(jù)粗細(xì)和長短，普遍認(rèn)為藥材越粗的等級越高，質(zhì)量越好。從此次研究結(jié)果來看，不同商品規(guī)格牡丹皮中均出現(xiàn)了傳統(tǒng)商品形態(tài)與有效成分含量不一致的情況，如銅陵、蕪湖和亳州的牡丹皮藥材越細(xì)，芍藥苷和丹皮酚成分含量越高，因此，綜合考慮，牡丹皮藥材劃分等級時應(yīng)考慮加入含量進行限量區(qū)分。

參考文獻

[1] 李時珍.本草綱目：第2冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：852-854.

[2] 蘇敬等撰，尚志鈞輯校.唐·新修本草[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1981：227-228.

[3] 馬子密，傅延齡.歷代本草藥性匯解[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，

2001：214-219.

[4] 謝宗萬，郝近大.常用中藥名與別名手冊[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：198-199.

[5] 嚴(yán)西亭，施澹寧，洪緝庵.得配本草[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994：54-55.

[6] 蘭州軍區(qū)后勤部衛(wèi)生部.陜甘寧青中草藥選[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1971：12-258.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：172.

[8] 楊光，王諾，詹志來，等.中藥材市場商品規(guī)格等級劃分依據(jù)現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國中藥雜志，2016，41（5）：761-763.

[9] 張雨鳳，王軍，方成武，等.牡丹皮藥材規(guī)格等級初探[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，34（5）：80-83.

[10] 李靜.亳州牡丹皮產(chǎn)地加工、儲藏方法及不同商品規(guī)格等級綜合質(zhì)量評價研究[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué)，2016.