深圳和太原PM2.5樣品致突變作用研究

鄭 凱，王冰玉，徐新云*，耿 紅，黃海燕劉 威龍鼎新

(1.深圳市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康所，廣東 深圳 518055；2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001；3.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西 太原 030006)

大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指空氣顆粒物中動力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，是空氣污染物的主要成分之一。PM2.5的成分十分復(fù)雜，包含多環(huán)芳烴、重金屬離子、硝酸鹽、亞硝酸鹽等多種具有致突變性和致癌性物質(zhì)，對人類健康造成了很大威脅[1-3]。PM2.5由于粒徑小、比表面積大、活性強、極易富集有毒有害物質(zhì)，而且可較長時間停留在空氣中，易被吸入肺泡并沉積，損害人體健康，當(dāng)接觸達到一定劑量后能夠引起呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和肺癌等多種疾病的發(fā)生[4-6]，國際癌癥機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)于2013年發(fā)布報告將PM2.5列為致癌物。Ames試驗是1975由Bruce N.Ames建立的一種檢測致突變性的試驗[7-8]，其原理是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his-)菌株在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，只有少數(shù)的細菌發(fā)生自發(fā)回復(fù)突變，形成在顯微鏡下才能看到的菌落。受誘變劑作用后，大量的細菌發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，形成肉眼可見的菌落。TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均屬于組氨酸缺陷型菌株，因此在Ames試驗中被廣泛使用。

山西太原作為我國的煤炭和重工業(yè)基地，是受霧霾天氣影響非常嚴重的地區(qū)之一；深圳作為我國經(jīng)濟特區(qū)之一，其環(huán)境質(zhì)量雖然在優(yōu)良水平，但近幾年也有少數(shù)時間受霧霾天氣的侵擾。眾所周知，在霧霾的組成成分中PM2.5對人類的健康影響大，因此本文利用Ames試驗中組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，使用平板滲入法通過Ames試驗檢測深圳和山西太原PM2.5樣品是否具有致突變作用，為深入研究PM2.5的致癌致突變分子機制、保護人類健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535購自美國MOLTOX公司；生物分子學(xué)瓊脂糖(certified molecular biology agarose)購自Bio-Rad公司；氧化型輔酶Ⅱ鈉鹽NADP Na2購自Solarbio公司；哺乳動物微粒體酶(S9)購自美國MOLTOX公司；D-生物素和L-組氨酸購自美國Sigma公司，D-葡萄糖6-磷酸鈉鹽(D-glucose 6-phosphate sodium salt)、四環(huán)素、氨芐青霉素購自Aladdin-e公司，營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司，葡萄糖購自購自美國Sigma公司，迭氮鈉購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，敵克松(fenaminosulf)購自AccuStandard公司，2-氨基芴(2-aminofluorene)購自J&K ScientificLTD公司，1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)購自美國AcrosOrganics公司。

1.2 菌株鑒定

按常規(guī)方法進行自發(fā)回變率、組氨酸缺陷型、四環(huán)素抗性、脂多糖屏障(raf)缺陷型、R因子(氨芐青霉素抗性)和紫外損傷(uvrB)修復(fù)的鑒定。

1.3 PM2.5樣品制備

分別在深圳和太原兩地采集PM2.5樣品，使用中流量大氣采樣器TH-150F，采樣流速100 L/min，采樣時間24 h，使用直徑為90 mm的濾膜收集PM2.5顆粒。將分別在深圳和太原采集好的3張PM2.5的濾膜稱重后剪成2 cm×2 cm大小分別放于帶標記的兩個燒杯中，并使有顆粒的一面朝上，加150 mL超純水使濾膜完全侵沒，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲提取30 min，用干凈的鑷子將燒杯中的濾膜取出，待PM2.5樣品懸濁液冷卻后分別轉(zhuǎn)移到兩個真空冷凍物料盤中并標記，用錫箔紙將物料盤口密封后放于-80℃冰箱冷凍24 h，再將物料盤口的錫箔紙取下，用封口膜密封并在封口膜上點許多密集的小孔，放在真空冷凍干燥機中干燥24 h(干燥時間由樣品的多少決定)使PM2.5完全干燥，將物料盤敞口放在無菌工作臺中照紫外燈2 h，用超純水溶解PM2.5樣品，收集PM2.5樣品溶液，-20℃保存待用。

1.4 Ames試驗

將深圳和太原PM2.5樣品分別用滅菌的超純水稀釋至0.4、1.0、2.0和4.0 mg/mL共4個濃度，作為受試物進行Ames試驗[7-9]。同時設(shè)置溶劑對照組和陽性對照組。陽性對照組不加S9時，TA97、TA98和TA102按每皿加入50 μg的敵克松，TA100和TA1535按每皿加入1.5 μg的疊氮鈉；陽性對照組加S9時，TA97、TA98、TA100和TA102按每皿加入10 μg的2-氨基芴，TA1535按每皿加入50 μg的二羥基蒽醌。采用平板滲入法，在2 mL頂層瓊脂中分別加入0.1 mL的菌液和0.1 mL的受試物，代謝活化組加入0.5 mL S9混合液，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上并鋪平。同時設(shè)置空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)和陽性對照組。每個組均設(shè)3個平行皿，37℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)每個平皿的回變菌落數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，所有實驗重復(fù)3次，用SPSS 24.0和Excel進行統(tǒng)計分析，各樣本實驗組和對照組以及加S9混合液和不加S9混合液的均數(shù)差異分析采用單因素t檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

組氨酸鑒定：5種菌株在不加組氨酸的培養(yǎng)基上均不能生長，在加入組氨酸的培養(yǎng)基上均能生長。raf鑒定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在結(jié)晶紫滲透的培養(yǎng)基區(qū)域上均有抑制帶，TA1535菌株在結(jié)晶紫滲透的培養(yǎng)基區(qū)域上沒有抑制帶。四環(huán)素抗性鑒定：只有TA102菌株在有四環(huán)素的區(qū)域生長，其余4種菌株不能生長，只有TA102菌株具有抗四環(huán)素效應(yīng)。R因子鑒定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在氨芐青霉素帶周圍可以生長，這4種菌株具有抗氨芐青霉素效應(yīng)，說明具有R因子，TA1535菌株在氨芐青霉素帶周圍生長受抑制，不具有抗氨芐青霉素效應(yīng)，說明不具有R因子。uvrB修復(fù)缺陷鑒定：TA97、TA98、TA100和TA1535菌株僅在沒有紫外線照射過的一半培養(yǎng)基上生長，為uvrB修復(fù)缺陷型菌株，TA102菌株經(jīng)紫外線照射過后能生長，TA102菌株具有uvrB修復(fù)。自發(fā)回變率的測定：5種菌株的自發(fā)回變率均在標準范圍之內(nèi)。菌株基因型和自發(fā)回變鑒定結(jié)果均符合使用標準，見表1。

表1 鼠傷寒沙門菌5種菌株生物學(xué)特性鑒定結(jié)果和自發(fā)回變率

2.2 深圳樣品的Ames試驗結(jié)果

4種不同濃度的深圳PM2.5樣品的水溶液加S9混合液與不加S9混合液均引起TA97回變菌落數(shù)大于空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數(shù)達到(34.0±9.1)個/皿，超過了陰性對照組[(14.3±2.6)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為100 μg/皿和200 μg/皿時不加S9混合液的回變菌落數(shù)達到(408.0±42.8)和(2 726.0±615.9)個/皿，超過了陰性對照組[(172.0±14.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為200 μg/皿和400 μg/皿時加S9混合液的回變菌落數(shù)達到(2896.7±175.1)和(2201.3±228.6)個/皿，超過了陰性對照組[(153.3±14.5)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液的回變菌落數(shù)達到(312.0±23.0)個/皿，超過了陰性對照組[(149.3±26.2)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA1535在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液的回變菌落數(shù)達到(32.3±1.7)個/皿，與陰性對照組[(26.0±0.8)個/皿]相比有顯著性差異(P＜0.01)。TA97在 PM2.5樣品濃度為200 μg/皿和400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數(shù)達到(1 358.7±79.8)個/皿、(1 586.7±101.5)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(shù)(900±46.3)個/皿、(1 039.3±68.9)個/皿相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。TA100和TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數(shù)達到(2 201.3±228.6)個/皿和(312.0±23.0)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(shù)(124.7±9.7)個/皿和(157.7±19.9)個/皿相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 太原樣品的Ames試驗結(jié)果

四種不同濃度的太原PM2.5樣品的水溶液加S9混合液與不加S9混合液均引起TA97回變菌落數(shù)大于空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液后回變菌落數(shù)達到(98.3±15.1)個/皿，超過了陰性對照組[(19.3±5.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為40、200和400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數(shù)達到(85.0±5.4)、(33.0±3.6)和(141.0±8.2)個/皿，超過了陰性對照組[(14.3±2.6)個/皿]的 2倍，可判為 Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液后回變菌落數(shù)達到(926.7±33.0)個/皿，超過了陰性對照組[(172.0±14.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為40和400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數(shù)達到(425.3±21.7)和(5 125.3±215.6)個/皿，超過了陰性對照組[(153.3±14.5)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數(shù)達到(247.0±41.1)個/皿，與陰性對照組[(149.3±26.2)個/皿]相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TA97在PM2.5樣品濃度為40和200 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數(shù)達到(2 970.7±343.2)個/皿和(3 428.0±295.2)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(shù)(370.0±76.1)個/皿和(1 754.7±137.2)個/皿相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。TA98和TA100在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數(shù)達到(141.0±8.2)個/皿和(5 125.3±215.6)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(shù)(98.3±15.1)個/皿和(926.7±33.0)個/皿相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 深圳與太原PM2.5樣品的Ames試驗菌株自發(fā)回變數(shù)結(jié)果

3 討論

本試驗結(jié)果顯示廣東深圳和山西太原兩個地區(qū)的PM2.5均具有致突變性，Bocchi[10]等人研究結(jié)果顯示，PM2.5的提取物能夠引起DNA損傷并在菌株回復(fù)突變試驗的結(jié)果中表明具有致突變性，這與本文試驗結(jié)果一致。

由于PM2.5的直徑比較小，可通過呼吸系統(tǒng)經(jīng)支氣管直接進入到肺泡深處，并在肺泡沉積，達到一定劑量后可引起機體發(fā)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及誘導(dǎo)基因突變，對人體健康造成嚴重危害。最近幾年來我國部分城市出現(xiàn)霧霾現(xiàn)象越來越嚴重，特別是京津冀、長江三角洲及珠江三角洲等地區(qū)的霧霾現(xiàn)象更為明顯。有研究表明，杭州在2001年霧霾天氣只有12天，而在2013年霧霾天氣增加到293天[11]。霧霾天氣的增加對人群健康都來很大影響，其中霧霾中對人類健康影響最大的部分是PM2.5。文獻報道PM2.5暴露與肺癌的形成密切相關(guān)，PM2.5含有的硝酸鹽、亞硝酸鹽等化合物以及重金屬元素能夠經(jīng)呼吸道進入肺泡深部，并在肺泡深部沉積，直接或者間接的作用與支氣管粘膜，引起肺上皮細胞發(fā)生基因突變[12]。隨著近20年來的霧霾天氣加重，我國肺癌發(fā)病率也明顯升高。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，昆山市2006年肺癌發(fā)病率為48.58/100萬，而2015年肺癌發(fā)病率增加到77.72/100萬，同比增長59.98%[13]；江西省2010—2014年肺癌發(fā)病率由38.62/100萬上升至43.92/100萬，同比增長13.72%[14]；江蘇省淮安市2009年肺癌發(fā)病率為28.36/100萬，2013年肺癌發(fā)病率上升到40.17/100萬，同比增長41.64%[15]。這些研究表明，近年來肺癌發(fā)病率增加與霧霾天氣增重有著密切的關(guān)系。

由于PM2.5成分比較復(fù)雜，現(xiàn)有資料表明，PM2.5含有大量的重金屬和多環(huán)芳烴類化學(xué)物，而部分重金屬和多環(huán)芳烴具有致突變性和潛在致癌性[16-18]。Gilli報道意大利都靈環(huán)境中PM2.5具有致突變性[19]，Belcik發(fā)現(xiàn)PM2.5具有基因毒性與細胞毒性[20]。本文采用Ames試驗檢測分析深圳和太原PM2.5樣品是否具有致突變作用，Ames試驗是檢測環(huán)境污染物或外來化學(xué)物質(zhì)致突變作用的經(jīng)典實驗，如果樣品在不加S9條件下引起測試菌株突變稱為直接致突變作用，如果樣品需要在加S9條件下通過體內(nèi)代謝活化才能引起測試菌株突變，則稱之為間接致突變作用。本文利用5種組氨酸缺陷型沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535檢測廣東深圳和山西太原兩地區(qū)PM2.5樣品的致突變作用，本試驗設(shè)立陽性對照組在加S9與不加S9活化條件下，5種菌株的回變菌落數(shù)均超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍，說明本試驗的研究體系完全符合要求而且具有可行性。加S9與不加S9活化條件下，TA97菌株在深圳和太原兩個地區(qū)PM2.5樣品各個濃度的回變菌落數(shù)均超過陰性對照組2倍，深圳和太原兩個地區(qū)的PM2.5樣品Ames試驗判為陽性，且加S9活化后回變菌落數(shù)明顯升高，說明深圳和太原兩地區(qū)PM2.5同時具有直接致突變和間接致突變作用。雖然本文使用的深圳和太原PM2.5樣品暫未公布成分檢測結(jié)果，但有作者報道太原PM2.5含As、Cd、Cu、Ni、Pb等重金屬濃度較高[16]，文獻報道As、Cd、Ni都具有一定的致癌致突變作用，可引起癌基因表達改變[17-18]，因此本文獲得的Ames實驗結(jié)果是非常有價值的，充分說明深圳和太原PM2.5樣品中存在一些致突變環(huán)境污染物，對于今后深入研究霧霾致癌致突變的分子機制提供了科學(xué)依據(jù)，同時對于保護環(huán)境和保護人群健康具有十分重要的理論意義與科學(xué)基礎(chǔ)。