納米氧化鈰顆粒對(duì)人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞輻射敏感性的影響

王春燕，佟 鵬，李 辰，邵 帥，曲功霖，茍 巧，王成芳，齊雪松*

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核安全應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

我國的肺癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中居首位[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)病率約占肺癌發(fā)病率的80%。鉑類藥物是一線化療藥物，但多次應(yīng)用后易產(chǎn)生耐藥性，因此，放化療結(jié)合是治療中晚期肺癌常采取的手段[2]。

NSCLC的輻射敏感性低，常規(guī)放療療效不佳[3]。臨床急需有效的手段增加其放射敏感性，目前相關(guān)的研究涉及熱療、放射增敏劑等[4-5]。納米氧化鈰晶體有較多的氧空位和比較低的氧化還原電勢(shì)，活性較高[6]。在對(duì)胰腺癌放射敏感性的研究中發(fā)現(xiàn)，納米氧化鈰聯(lián)合放療可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[7]。本項(xiàng)目以人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞(A549/DDP)為研究對(duì)象，觀察納米氧化鈰與γ射線聯(lián)用的殺傷能力，為NSCLC的輻射增敏提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和受試物

人肺腺癌耐順鉑A549/DDP細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所)。采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下常規(guī)培養(yǎng)。納米氧化鈰懸液由有色金屬研究院合成并贈(zèng)予，一次粒徑為2～4 nm。將納米氧化鈰與超純水混合配置成10 mmol/L貯存液(混懸液)，備用。

1.2 主要試劑和儀器

CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購自同仁化學(xué)研究所，姬姆薩染液即用型購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑VybrantDycCycle Orange染料購自英濰捷基公司，乙酰甲酯熒光探針(BCECFAM)購自美國Sigma公司。二氧化碳培養(yǎng)箱為美國Thermo公司生產(chǎn)，全波長酶標(biāo)儀為美國Thermo公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為美國BD公司生產(chǎn)，鈷源為北京師范大學(xué)輻照中心所有。

1.3 確定輻射半數(shù)抑制劑量和納米氧化鈰濃度

細(xì)胞分為7組，分別對(duì)照組以及2、4、8、16、24、32 Gy γ射線照射組，每組6個(gè)平行樣。細(xì)胞接種于96孔板中，每孔2 000個(gè)，24 h后給予60Co γ射線照射，劑量率為1 Gy/min，照射后連續(xù)培養(yǎng)5 d，用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，建立劑量-效應(yīng)曲線，并計(jì)算得到A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量。在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入終濃度為500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.000 5和0.000 05 μmol/L 的納米氧化鈰，24 h后給予半數(shù)抑制劑量的60Co γ射線照射，照后24 h用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，根據(jù)每種細(xì)胞的增殖抑制率變化選定納米氧化鈰濃度。

1.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞按照射劑量分為6組，分別為0、1、2、4、6和8 Gy，接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，每組6個(gè)皿，每皿112個(gè)。待細(xì)胞貼壁后每組取3皿加入終濃度為0.000 5 μmol/L的納米氧化鈰，作用24 h，這些細(xì)胞為納米氧化鈰組，其余未添加納米氧化鈰的細(xì)胞為照射組，將所有細(xì)胞分別給予上述劑量的60Co γ射線照射，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下連續(xù)培養(yǎng)20 d。棄培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入3.5 mL甲醇，固定10 min。然后用Giemsa染色，沖洗晾干后，細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，用于存活分?jǐn)?shù)的計(jì)算。根據(jù)單擊多靶模型SF=1-(1-e-kD)n計(jì)算細(xì)胞的平均致死劑量(D0)、靶數(shù)(n)準(zhǔn)閾劑量(Dq)和2 Gy照射后的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)。根據(jù)線性二次模型SF=aD-bD2計(jì)算一次斷裂系數(shù)(a)、二次斷裂系數(shù)(b)和2 Gy照射后的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組和處理將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組，照射組，以及納米氧化鈰低、中、高濃度(分別為0.000 5、0.05、5 μmol/L)處理組。陰性對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何處理；照射組細(xì)胞給予半數(shù)抑制劑量60Co γ射線照射，劑量率為1 Gy/min；納米氧化鈰處理組細(xì)胞于貼壁后加入不同濃度的納米氧化鈰，24 h后給予半數(shù)抑制劑量60Co γ射線照射，劑量率為1 Gy/min。照后24 h用25%胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和胞內(nèi)pH值。

1.5.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)按照FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

1.5.3 細(xì)胞周期檢測(cè)按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑VybrantDycCycle Orange染料操作規(guī)程標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)配制pH分別為5.78、6.28、6.78、7.24、7.69和8.48的標(biāo)準(zhǔn)溶液，把細(xì)胞分別混入到上述不同pH值的溶液中，加入BCECF-AM避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，獲得FL1/FL2比值(熒光強(qiáng)度比值)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備的細(xì)胞懸液加入BCECF-AM避光孵育，Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)，清洗重選后過膜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算FL1/FL2比值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出pH值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用等方差t檢驗(yàn)；若方差不齊，編秩后采用 LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 確定照射劑量和納米氧化鈰使用濃度

通過不同劑量的γ射線誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞，計(jì)算抑制率，建立劑量-效應(yīng)曲線(圖1A)，確定γ射線誘導(dǎo)其的半數(shù)抑制劑量為25 Gy。采用用不同濃度納米氧化鈰處理后給予半數(shù)抑制劑量的γ射線作用，與對(duì)照組相比，各濃度組(分別為500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.000 5和0.000 05 μmol/L)的細(xì)胞增殖抑制率均 顯 著 增 加 (tLSD=6.63、 4.12、 3.53、 4.12、 2.65、2.41、2.36和2.5，P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。結(jié)合文獻(xiàn)[7]確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的終濃度為0.000 5、0.05和5 μmol/L。

圖1 γ射線單獨(dú)作用和納米氧化鈰處理后給予γ射線照射對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響

2.2 納米氧化鈰處理對(duì)γ射線照射A549/DDP細(xì)胞存活的影響

通過細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，可觀察到，與單獨(dú)照射組細(xì)胞比較，低濃度納米氧化鈰處理24 h后給予半數(shù)抑制劑量γ射線照射可使A549/DDP細(xì)胞克隆數(shù)減少(圖2A)。未照射且未添加加納米氧化鈰組得到細(xì)胞的接種效率約為95.6%，按此計(jì)算各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，建立單擊多靶模型和線性二次模型。同樣可以看出，與單獨(dú)照射比較，納米氧化鈰處理可使A549/DDP細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)下降(圖2B、2C)。

圖2 納米氧化鈰處理后給予γ射線照射的A549/DDP細(xì)胞存活的濃度效應(yīng)關(guān)系

單擊多靶模型和線性二次模型的參數(shù)由表1列出。與單獨(dú)照射比較，單擊多靶模型分析發(fā)現(xiàn)納米氧化鈰處理后細(xì)胞的平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)和2 Gy照射后的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)均下降，雖然靶數(shù)(n)沒有增加，但經(jīng)線性二次模型分析發(fā)現(xiàn)納米氧化鈰處理后細(xì)胞的SF2，且a/b比值升高，表明低濃度納米氧化鈰可促使A549/DDP細(xì)胞較早出現(xiàn)射線誘導(dǎo)的損傷效應(yīng)，與單純照射相比較，增敏比(SER)提高至1.1倍。

表1 單擊多靶模型和線性二次模型結(jié)果比較

2.3 納米氧化鈰處理對(duì)γ射線照射A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)納米氧化鈰處理后γ射線照射A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行凋亡率的檢測(cè)，結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)納米氧化鈰低濃度組的凋亡率為0.6%，比單獨(dú)照射組的凋亡率0.17%明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.42，P＜0.05)。

圖3 納米氧化鈰處理后γ射線照射A549/DDP細(xì)胞凋亡的變化

2.4 納米氧化鈰處理對(duì)γ射線照射A549/DDP細(xì)胞周期的影響

由圖4可見，單獨(dú)照射組S期細(xì)胞百分比為46.3%，采用低、中、高濃度納米氧化鈰處理后給予射線照射的S期細(xì)胞百分比分別為71.2%、72.1%和84.3%，各濃度組納米氧化鈰可導(dǎo)致細(xì)胞S期阻滯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.14、4.08、6.81，P＜0.05)。

圖4 納米氧化鈰處理后γ射線照射A549/DDP細(xì)胞周期的變化

2.5 納米氧化鈰處理對(duì)γ射線照射A549/DDP細(xì)胞內(nèi)pH的影響

通過對(duì)pH標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.19x+0.15，R2=0.97。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出各樣品的胞內(nèi)pH值。如圖5所示，單獨(dú)照射組的胞內(nèi)pH值為6.06，納米氧化鈰低、中、高濃度組pH值分別為6.1、6.11和6.13。與單獨(dú)照射組相比，納米氧化鈰低和高濃度組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.86、4.93，P＜0.05)。

圖5 納米氧化鈰處理后γ射線照射A549/DDP細(xì)胞內(nèi)pH值的變化

3 討論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米物質(zhì)輻射增敏的相關(guān)研究逐漸增多。鹽藻依聚糖-二氧化錳的納米顆?？梢跃徑饽[瘤組織的乏氧現(xiàn)象，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)X射線的輻射敏感性[8]。納米金膠體[9]和納米銀顆粒[10]均可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，使其對(duì)X射線的輻射敏感性增強(qiáng)。氧化鐵的納米復(fù)合顆粒可通過降低U251細(xì)胞的自噬，使其對(duì)X射線是輻射敏感性增強(qiáng)[11]。納米硅顆粒誘導(dǎo)HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)X射線的輻射敏感性，使其凋亡增加[12]。但納米顆粒對(duì)γ射線的增敏作用的研究并不多見。

本項(xiàng)目的研究發(fā)現(xiàn)低濃度納米氧化鈰處理后γ射線照射使A549/DDP細(xì)胞的SF2降低、a/b比值和SER值升高，表明在納米氧化鈰的作用下，細(xì)胞對(duì)射線的敏感性增強(qiáng)，且增敏作用與N值無關(guān)，與納米氧化鈰顆粒更易誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早期損傷有關(guān)。低濃度納米氧化鈰處理后γ射線照射A549/DDP細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明納米氧化鈰的濃度在0.000 5 μmol/L時(shí)更易使細(xì)胞發(fā)生凋亡，此濃度與納米氧化鈰致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞輻射增敏的濃度一致[13]。低濃度的納米氧化鈰顆粒還可使A549/DDP細(xì)胞的S期阻滯明顯增加，這可能是細(xì)胞凋亡增加的原因。由于腫瘤細(xì)胞需要借助糖酵解途徑對(duì)葡萄糖加以吸收，以生成能量來促進(jìn)自身的生長[14]，因此其生存的微環(huán)境中乳酸堆積，pH偏酸，可使一些堿性化療藥物失效，產(chǎn)生耐藥性[15]。而納米氧化鈰本身具有類似超氧化物歧化酶的作用[16]，可調(diào)節(jié)細(xì)胞外的偏酸性環(huán)境，隨后的射線作用提高了A549/DDP細(xì)胞內(nèi)pH值，破壞了細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，促使細(xì)胞凋亡或死亡，這可能是低濃度的納米氧化鈰顆粒致A549/DDP細(xì)胞輻射敏感性增強(qiáng)的又一原因。

輻射增敏一直是臨床放療過程中亟待解決的難題，尤其是對(duì)輻射敏感性較低的癌癥或腫瘤急需找到低毒、高效的增敏劑。納米氧化鈰以其易獲得、易純化、成分單一等優(yōu)勢(shì)，成為一種有潛力的輻射增敏劑，越來越受到研究者的關(guān)注[17]。

(感謝有研稀土新材料股份有限公司稀土材料國家工程研究中心贈(zèng)送納米氧化鈰懸浮液和對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究的支持)