旁斑蛋白組成成分1的結構與生物學功能研究進展

徐賢榮，楊 軍*

(杭州師范大學醫(yī)學院預防醫(yī)學系，浙江 杭州 310036)

旁斑蛋白組成成分1(paraspeckles protein component 1，PSPC1/PSP1)是一種新近發(fā)現的細胞核內核旁斑點(paraspeckle)結構蛋白，屬于果蠅行為/人類剪接蛋白家族(drosophila behavior/human splicing，DBHS)。PSPC1與DBHS蛋白家族其他兩個成員，含八聚體結合蛋白的非POU結構域(non-POU-domain-containing octamer binding protein，NONO)和富含脯氨酸/谷氨酰胺的剪接因子(splicing factor proline/glutamine rich，SFPQ/PSF)，以及長鏈非編碼RNA NEAT 1共同構成了旁斑結構。DBHS家族蛋白幾乎參與細胞基因調控的每一步，包括轉錄調控、RNA加工和轉運、DNA修復等過程。盡管DBHS蛋白作為一個整體已經被證明具有重要的生物學功能，但有關PSPC1的相關研究仍處于起步階段，其具體生物學功能依然有許多不明確的地方。本文就PSPC1的結構與生物學功能研究進展進行綜述。

1 PSPC1的發(fā)現

2002年，Fox等應用蛋白組學技術對細胞核蛋白進行分析，發(fā)現了271種蛋白，其中80種蛋白由未知功能的基因所編碼[1]。其中，有一種蛋白在染色質間隙的核旁斑點中聚集，被命名為PSPC1。他們發(fā)現，應用放線菌素D(actinomycin D)抑制RNA轉錄的情況下，PSPC1在細胞核內聚集，這引起了他們的興趣，從而對其進行了進一步的研究。在放線菌素D處理細胞后，熒光素標記的PSPC1蛋白信號在核質中逐漸消失，而在核仁帽狀結構中開始出現。由于核旁斑點本身沒有出現位置變化，作者認為PSPC1蛋白是從核旁斑點中逸出后在核內單獨聚集，可能參與細胞核內重要的生物學功能[2]。PSPC1的發(fā)現及其在細胞基因調控中的表現引起了人們的關注，從而開展了與之有關的相關研究。

2 PSPC1的結構

PSPC1由532個氨基酸組成，相對分子質量約為5.82×104，含有兩個異構體，分別稱之為PSPC1-α和PSPC1-β。PSPC1在哺乳動物中高度保守，人類與小鼠的同源性高達95%[1]。和所有的DBHS家族蛋白一樣，PSPC1具有一段300個氨基酸左右長度的高度保守序列，包含兩個串聯的N-末端RNA識別區(qū)域(RNA recognition motifs，RRMs)，一個含52個氨基酸的非腺苷酸/旁斑區(qū)域(nonA/paraspeckle domain，NOPS)和一個約100個氨基酸的C-末端卷曲螺旋(圖1)。RRMs是高等脊椎動物中最為豐富的RNA結合域(在人類中占基因總量的0.5%～1%)，典型的RRM包含約90個氨基酸序列，兩個RRM之間由7個彈性氨基酸序列所串聯[3]。其中RRM1結構較為固定，由4個芳香族氨基酸殘基構成，形成β1α1β2β3α2β4拓撲結構，為重要的RNA結合區(qū)域；RRM2中則4個保守的氨基酸殘基分別被蘇氨酸，賴氨酸和異亮氨酸所取代，在3環(huán)和5環(huán)上形成額外的β折疊；其中的一個具有高度保守序列，代表一個雙鏈DNA/RNA識別區(qū)域，提示其結合RNA的能力較差或者結合的形式較為特殊。RRMs上的這些殘基對于DBHS蛋白相互作用，并參與形成旁斑的過程發(fā)揮關鍵的作用。NOPS區(qū)域自RRM2末端延伸出來，連接卷曲螺旋結構，參與PSPC1與其他DBHS蛋白之間二聚體的形成，其表面的堿性氨基酸殘基也可與核酸相結合。C末端的卷曲螺旋為高度有序序列，能夠形成二聚體或寡聚體，在形成二聚體時，呈現右旋反并聯結構。

圖1 PSPC1二級結構示意圖

3 PSPC1生物活性形式

PSPC1最初作為旁斑結構的組分，是旁斑的標志之一。在形成旁斑過程中，以一種長鏈非編碼RNA——NEAT1作為骨架，招募PSPC1和其他DBHS蛋白(NONO和PSF/SFPQ)結合于其上。在旁斑結構中，PSPC1、NONO和PSF/SFPQ能夠結合到特定mRNA腺苷(A)-I(肌酐)反向重復發(fā)卡樣序列上，將這些RNA滯留在細胞核內，并在旁斑結構中接受編輯。

PSPC1以二聚體或與其他DBHS蛋白形成異二聚體形式發(fā)揮作用，其中異二聚體的穩(wěn)定性大于二聚體(圖2)。PSPC1與NONO或PSF/SFPQ均能夠形成異二聚體結構，在小鼠睪丸支持細胞中已經觀察到3種蛋白之間形成的異二聚體[4]。二聚體的形成，不僅對于PSPC1結構完整性至關重要，還決定其生物學功能的發(fā)揮。Passon等在2011年首次觀察到了PSPC1-NONO異二聚體結晶[5]，并在后續(xù)的研究中對其結構和組成進行了詳細的闡述[6]。PSPC1-NONO異二聚體以右旋反向螺旋結構形式存在，4個RNA識別結構區(qū)域每兩個分別在兩側形成一個20埃的通道樣結構。形成二聚體的過程中，70%的縮合結構位于C末端，形成假性的對稱結構。相反，在N末端兩個RMM1區(qū)域出現了斷裂，呈現相互疊加。兩個分子中，25%親水性的結構在形成二聚體的過程中分解，每個單倍體43%的殘基直接參與二聚體相互作用界面的形成。蛋白相互作用面延伸至整個蛋白上，4個部分均參與其中。由于在相互作用過程中，兩者發(fā)生分解和重構，在體內無法獨立穩(wěn)定存在，可能為特異性異二聚體[7]。此外，界面間隙表明這種結構僅僅是過渡性的蛋白質-蛋白質相互作用形式[7]，說明這種二聚體存在相互交換的動態(tài)過程。這種交換在無脊椎動物DBHS蛋白的進化過程中持續(xù)存在，通過組成不同的二聚體或異二聚體從而不斷增加DBHS蛋白的功能。

Huang等人在新近的研究中明確了PSPC1-SFPQ異二聚體的晶體結構[8]。與以前發(fā)現的DBHS蛋白相互作用結構類似，由于兩者序列之間高度的相似性(74%相同，93%類似)，PSPC1-SFPQ異二聚體呈現一個假性對稱結構。RRM2、NOPS和卷曲螺旋組成了相互作用的主要部分。由于天然的高度疏水性，三者形成相互作用面在兩個蛋白之間形成右旋的卷曲螺旋結構。進一步分析發(fā)現，兩種蛋白超過40%的殘基參與相互作用面的形成，主要通過疏水鍵維持這種結構。PSPC1-SFPQ異二聚體的結合力是SFPQ二聚體的10倍，是NONO-SFPQ二聚體的6倍。

圖2 PSPC1的3種二聚體形式和結構[9]

4 PSPC1的生物學功能

最初，PSPC1很大程度上作為旁斑的特異性標志物被人們所認識，但又不是旁斑形成的必要條件，其具體作用并不清楚。后續(xù)的研究陸續(xù)證明，PSPC1可能在其他方面發(fā)揮重要作用，包括DNA損傷修復，細胞分化和周期調控，癌癥的發(fā)生與發(fā)展，神經退行性疾病等。

4.1 參與細胞DNA損傷修復

DBHS蛋白能夠參與DNA雙鏈斷裂(double-stranded break，DSB)修復，其類型包括同源定向修復或非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)。研究發(fā)現，PSF/SFPQ在多種細胞中均具有促進同源DNA配對，互補寡核苷酸侵入超螺旋DNA，D-環(huán)形成和加強拓撲異構酶活性的作用。SFPQ/NONO復合物能夠結合Ku蛋白和底物DNA[10]，并直接與RAD51[11]，TopBP1[12]，和Matrin3[13]相互作用，將蛋白質募集到DNA損傷位點[14]，大大加快同源和非同源修復速度。當NONO缺乏的情況下，細胞內PSPC1蛋白出現表達上調，并與PSF/SFPQ形成穩(wěn)定的復合物，替代NONO的功能，參與細胞DNA修復過程。在NONO缺陷的背景下，敲除PSPC1將會導致細胞出現高度的放射敏感性和DNA損傷修復延遲，表明PSPC1參與DNA損傷修復過程[15]。

Wu等對PSPC1在DNA損傷修復中的作用進行了進一步的研究。結果發(fā)現，應用順鉑誘導HeLa細胞DNA損傷后，細胞中PSPC1出現表達上調，說明PSPC1可能參與DNA損傷過程[16]。采用siRNA技術下調細胞PSPC1表達后，細胞生長顯著受到抑制，自發(fā)凋亡增加，DNA損傷加重。但進一步研究發(fā)現，PSPC1并不與DNA損傷修復相關的蛋白，包括γH2AX、53BP1或Rad51共定位，表明其可能不直接參與DNA損傷修復過程[17]。分析其分子機制發(fā)現，當細胞PSPC1表達下調時，細胞逃脫了G1/S相檢驗點，更多的細胞進入G2/M相，導致DNA損傷修復障礙，引起更多細胞出現凋亡[17]。在甲磺酸甲酯誘導的細胞DNA損傷中同樣發(fā)現，敲除PSPC1將使得更多細胞逃脫G1/S檢驗點，進入G2/M相，導致細胞出現有絲分裂災難，加重細胞凋亡；高表達PSPC1則能夠使更多細胞停滯在G1/S相[18]。以上結果表明，PSPC1更可能是參與G1/S檢驗點調控的一個重要分子，在DNA損傷的情況下被誘導高表達，進而激活G1/S檢驗點，使得細胞周期停滯，細胞得以對DNA損傷進行修復；而當其被抑制時，G1/S檢驗點無法被激活，損傷的DNA無法得到修復并進入到G2/M期，最終導致死亡[18]。其課題組還通過蛋白質組學和免疫共沉淀的方法分析了PSPC1調控細胞周期的機制，發(fā)現PSPC1能夠與調控細胞周期的重要蛋白質——ATP互作蛋白(ATR-interacting protein，ATRIP)之間發(fā)生相互作用，提示PSPC1可能通過該機制發(fā)揮其生物學功能(待發(fā)表)。

4.2 其他功能

4.2.1 調控DNA甲基化修飾Guallar等研究發(fā)現，PSPC1能夠與DNA甲基化修飾作用密切相關的蛋白——10-11易位蛋白2(Ten-eleven translocation protein 2，TET2)相互結合，將其招募到染色體上。PSPC1和TET2通過組蛋白脫乙?；傅霓D錄抑制和通過5-羥甲基胞嘧啶修飾的RNA的轉錄后去穩(wěn)定化，促進內源性逆轉錄病毒關的基因調控過程[19]。

4.2.2 補償NONO功能DBHS蛋白家族中的NONO蛋白是多種生命活動中的關鍵分子，調控細胞周期節(jié)律、DNA損傷修復以及神經細胞功能完整。在缺失NONO蛋白的情況下，其功能在一定程度上由PSPC1進行補償。Li等人研究發(fā)現，在DNA修復過程中，敲除NONO之后，PSPC1表達出現上調，并與SFPQ形成功能性異二聚體，補償NONO的功能，從而完成DNA的修復過程[15]。Ha等人發(fā)現，在DNA損傷過程中，當NONO數量不足的情況下，PSF能夠誘導PSPC1共定位到DNA損傷部位，促進DNA修復過程，而在NONO數量充足的情況下不直接參與DNA修復[14]。

Yamamoto等人也發(fā)現，在前列腺癌細胞系——LNCaP-SF中，沉默NONO表達后，PSPC1表達出現顯著上調[20]。然而，PSPC1對于NONO的一些特殊功能可能沒有補償作用，如在小鼠中敲除NONO導致的行為異常，以及人體中NONO基因缺陷導致的智力障礙[21]。

4.2.3 參與癌癥形成研究發(fā)現，在卵巢癌組織中，PSPC1表達下調[22]。Silva等研究發(fā)現，一種多腺苷酸化長期應激誘導的長鏈非編碼RNA——LSINCT5在乳腺癌和卵巢癌細胞中出現過度表達。下調其在細胞中的表達后，細胞增殖出現抑制，其中PSPC1基因也出現了顯著的下調[23]。在乳腺癌細胞中研究發(fā)現，采用二甲雙胍處理細胞后，細胞內PSPC1表達水平與細胞對二甲雙胍反應性密切相關，提示PSPC1參與癌細胞代謝過程中[24]。對結腸癌細胞核蛋白進行分析發(fā)現，與正常細胞相比，PSPC1蛋白表達量顯著提高[25]。在結腸癌患者中，其癌組織PSPC1蛋白表達豐度與臨床結局密切相關。

Yeh等人在多種類型的癌癥中開展調查，研究PSPC1參與癌癥發(fā)展的機制[26]。他們發(fā)現，PSPC1在多種癌癥中出現上調，包括晚期的肺癌，乳腺癌和肝癌，并且導致臨床結局不良。進一步研究發(fā)現，PSPC1能夠增加癌細胞的侵襲和轉移能力，可與磷酸化狀態(tài)的Smad2/3分子相互作用，調控細胞核內Smad2/3信號通路，增加癌細胞中轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)分泌。此外，研究還顯示PSPC1能夠改變Smad2/3蛋白對不同基因的結合優(yōu)先度，調控促癌和抑癌基因的表達，并在其中發(fā)揮主導性作用。這些研究結果提示癌細胞中存在PSPC1-Smad2/3-TGF-β1作用軸，PSPC1可能作為抗癌治療的一個新靶點。

4.2.4 神經退行性疾病Yu等人以3xTg-AD小鼠為研究對象，在飲水中添加低劑量銅干預，并對其行為和腦部海馬線粒體和核蛋白進行分析。結果表明，小鼠大腦海馬部位氧化應激和DNA損傷水平顯著增加，突觸相關蛋白表達降低，同時PSPC1表達出現顯著下降，提示其可能參與重金屬誘導AD的發(fā)病過程[27]。Shi等人同樣研究發(fā)現，在攜帶有3種人類變異基因，可產生β淀粉樣變的Tg小鼠中(3xTg-AD小鼠)，其大部分皮質神經元中均缺乏PSPC1，而在普通的Tg小鼠和對照小鼠的皮質中則沒有發(fā)現這種現象。Western blot的結果也顯示，在3xTg-AD小鼠海馬部位的細胞核內，PSPC1的表也出現顯著下降。這些結果表明，PSPC1可能在AD發(fā)病過程淀粉樣變所致神經元損傷中發(fā)揮一定作用[28]。

4.2.5 調控脂肪細胞功能Wang等研究發(fā)現，PSPC1可能參與調控脂肪細胞的形成和功能調控。在體外研究中，PSPC1結合到許多脂肪細胞RNA 3'非編碼區(qū)，包括RNA編碼轉錄調控因子-早期B細胞因子1(early B cell factor 1，EBF1)。從脂肪細胞中純化旁斑結構復合體后發(fā)現，PSPC1與RNA轉運因子-DEAD盒RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3，DDX3X)存在密切聯系，并呈現分化依賴的模式。尤其需要注意的是，PSPC1在分化過程中從細胞核中逸出到細胞質的過程中伴隨著脂肪形成相關RNA轉運增加。缺乏PSPC1的小鼠脂肪中出現脂質儲存和脂肪組織總量下降，并因為補償性的能量消耗增加而對膳食誘導的肥胖和胰島素抵抗具有耐受能力。這些發(fā)現表明PSPC1依賴的RNA成熟在脂肪生成和功能的轉錄后調控中發(fā)揮一定的作用[29]。

4.2.6 保護生殖細胞此外，在鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯誘導的睪丸支持細胞損傷過程中發(fā)現，PSPC1和NONO均出現了上調；在抑制NONO和PSPC1表達時，細胞出現氧化應激水平增強，凋亡增加[30]。進一步探討其機制發(fā)現，PSPC1和NONO能夠協同結合到乙醛脫氫酶1 DNA促進子CCGGAGTC區(qū)域，轉錄激活乙醛脫氫酶1，從而延緩鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯所引起的細胞損傷。

5 小結

近年來的研究表明，PSPC1不僅僅是旁斑蛋白的結構性組分，同時可能是具有核心功能作用的生物大分子。然而，其發(fā)揮作用的機制及其在細胞整體的生物學網絡中的地位還有待明確。例如，其在多種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，是通過多種不同的機制還是以同一種作用機制的不同表現形式發(fā)揮效應，還不得而知。深入研究PSPC1的生物學功能及其作用機制，將有助于進一步理解細胞生物學過程，為疾病防治提供有益的信息。