PM2.5對支氣管上皮細胞DNA損傷作用研究

王冰玉，鄭 凱，徐新云*，謝紅衛(wèi)*，于軍暉龍鼎新

(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽421001；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康所，廣東 深圳 518055)

2013年國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將室外空氣污染被歸類為一類致癌物質(zhì)，而室外空氣污染的主要成分——大氣顆粒物也被歸類為致癌物[1-2]。大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是一種直徑≤2.5 μm的空氣污染物，其特點是粒徑小，表面積大，毒素吸收能力強[3-5]。作為國際公認的致癌物PM2.5，其攜帶的多環(huán)芳烴和硝基化合物(如硝基-多環(huán)芳烴、3-硝基苯并蒽酮)被認為是主要致癌化合物[6]。當細胞的DNA損傷后會導(dǎo)致細胞的癌變，細胞DNA修復(fù)不及時、不充分或修復(fù)錯誤而進入細胞周期，可發(fā)生DNA加合物形成、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂、堿基錯配、脫堿基位點、堿基的插入或缺失等DNA損傷表現(xiàn)。有研究表明PM2.5可造成肺泡II型上皮細胞DNA損傷[7]，PM2.5暴露可引起ROS的產(chǎn)生和DNA損傷，影響胎兒的組織器官形成，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[8]。為了深入探討PM2.5對DNA造成的損傷及其修復(fù)機制，本文以人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，HBE)為實驗對象，采用單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測PM2.5致HBE細胞DNA損傷情況，熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)檢測PM2.5對HBE細胞DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達影響，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測DNA損傷修復(fù)基因的蛋白表達變化，為進一步研究PM2.5對DNA氧化損傷和DNA損傷修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細胞購于中國上海細胞庫，PM2.5樣品來源山西太原，K2CrO4購于Sigma公司，胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA購于美國Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司，SYBR PremixExTaq、PrimeScript RT reagent Kit和RNeasy Mini Kit購于日本TaKaRa公司，hOGG1、hMTH1基因PCR引物由上海生工合成，hOGG1(ab124741)和hMTH1(ab-200832)抗體購于英國Abcam公司，二抗抗體(羊抗兔IgG-HRP)購于美國Thermo Scientific公司。單細胞凝膠電泳所需細胞裂解液、電泳緩沖液及中和液所需試劑，購于上海生工公司；正常融點瓊脂糖和低熔點瓊脂糖，購于美國BBI公司。倒置熒光顯微鏡和瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 PM2.5采集和樣品處理

實驗用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣，每天采樣24 h，由于山西太原是我國霧霾嚴重城市之一，所以PM2.5采樣地點在山西省太原市山西大學(xué)校園內(nèi)，采集時間為2018年12月。將吸附有PM2.5顆粒的石英濾膜剪成4小塊放入裝有超純水的燒杯中，用錫紙包住口，超聲振蕩30 min洗脫PM2.5顆粒物，冷卻至室溫后放入-80℃冰箱。然后將樣品洗脫液真空冷凍干燥24 h后照紫外1 h，加入無菌水制備成PM2.5樣品儲備液，高壓滅菌后可用于細胞實驗，使用前震蕩混勻。

1.3 細胞培養(yǎng)與染毒處理

HBE細胞培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的70%～80%左右，將培養(yǎng)的細胞消化下來進行計數(shù)，調(diào)節(jié)懸液濃度，然后以5×105/mL的濃度接種到6孔板，每孔加2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，待細胞鋪滿瓶底面積80%左右進行PM2.5水溶液染毒處理。根據(jù)課題組前期進行的細胞毒性實驗結(jié)果，確定單細胞凝膠電泳實驗使用PM2.5水溶液濃度分別是0(陰性對照組)、8、20、50 μg/mL，染毒24 h。DNA損傷修復(fù)基因表達水平的檢測，采用PM2.5水溶液的終濃度分別為0、10和50 μg/mL，染毒24 h，以10 μmol/L的K2CrO4(以下用Cr6+表示)水溶液為陽性對照組。

1.4 單細胞凝膠電泳檢測HBE細胞DNA損傷

使用上述方法將細胞培養(yǎng)與染毒后，預(yù)冷PBS洗2次，消化細胞，室溫3 000 r/min離心5 min，200 μL PBS重懸細胞。第1層膠用0.75%正常熔點瓊脂糖150 μL鋪于磨砂載玻片上，室溫下固化10 min；將20 μL細胞懸液與80 μL質(zhì)量分數(shù)為0.6%的低熔點瓊脂糖充分混勻，迅速鋪第2層膠，4℃凝固約20 min，去掉蓋玻片，將載玻片浸入新鮮的冷細胞裂解液中，4℃靜置2 h。放入堿性電泳液中平衡20 min，然后在恒壓25 V、300 mA的條件下電泳25 min。取出玻片至中和液中和3次，每次5 min，晾干，碘化丙啶避光染色20 min。在熒光顯微鏡下，每片隨機觀察計數(shù)100個細胞并拍照，用彗星圖像分析軟件進行分析，以尾部DNA百分率和尾長作為綜合指標進行評價。

1.5 PCR引物設(shè)計與合成

在Genbank上找到目的基因mRNA序列，用軟件選取CDS兩端的序列進行分析，按照引物設(shè)計的原則確定qPCR上下游引物，目的基因熒光定量PCR引物見表1。委托上海生工公司按照表1合成qPCR上下游引物。

1.6 熒光定量PCR測定DNA損傷修復(fù)基因的mRNA表達水平

提取HBE細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR反應(yīng)按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書步驟操作。各基因PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列見表2。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH的CT值為內(nèi)參，目的基因CT值采用 2-ΔΔCT

表1 目的基因熒光定量PCR引物

計算后的比值即為各基因的相對表達水平，此步驟由ABI7900HT分析軟件自動計算并直接給出結(jié)果。

1.7 Western blot檢測DNA損傷修復(fù)基因的蛋白表達水平

細胞染毒結(jié)束后，倒棄細胞培養(yǎng)液，用冷PBS清洗3次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，100℃變性8 min；用BCA法進行蛋白定量。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次加入蛋白樣品；濃縮膠于80 V條件下電泳30 min，分離膠于120 V條件下電泳50 min。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，按0.8 mA/cm2膠面積設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流，恒流轉(zhuǎn)膜100 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據(jù)各目的蛋白相對分子質(zhì)量大小，切取膜上相應(yīng)條帶，按抗體說明書上的比例加入相應(yīng)的一抗后冰上孵育過夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。按1∶3 000比例稀釋HPR標記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后用冷CCD成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進行條帶灰度定量分析。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差(xˉ±s)表示，所有實驗重復(fù)3次；應(yīng)用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對照組和PM2.5水溶液染毒組各指標間差異的分析采用單因素方差分析進行多組間比較，LSD法進行兩兩比較，以α=0.05為檢測水準。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5水溶液染毒后HBE細胞DNA損傷情況

SCGE檢測細胞DNA損傷情況見圖1～4，隨著PM2.5水溶液濃度的增加，HBE細胞DNA損傷程度逐漸加重，8.0 μg/mL組細胞DNA尾部DNA含量、尾長、尾距與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；20和50 μg/mL組細胞DNA百分含量、尾長、尾距與陰性對照組相比顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

圖1 熒光顯微鏡觀察PM2.5水溶液染毒后細胞DNA損傷的彗星圖像

圖2 PM2.5水溶液染毒細胞后SCGE檢測細胞尾部DNA含量

圖3 PM2.5水溶液染毒細胞后SCGE檢測細胞尾長

圖4 PM2.5水溶液染毒細胞后SCGE檢測細胞尾距

2.2 PM2.5水溶液染毒后HBE細胞DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達水平變化

qPCR檢測結(jié)果見圖5和圖6，與陰性對照組比較，hOGG1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及陽性對照Cr6+染毒后表達水平分別升高75.0%、132.0%、214.0%，hMTH1 mRNA在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+水溶液染毒后表達水平分別升高61.0%、144.0%、75.0%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖5 PM2.5對HBE細胞hOGG1 mRNA表達水平的影響

圖6 PM2.5對HBE細胞hMTH1 mRNA表達水平的影響

2.3 PM2.5水溶液染毒后HBE細胞hOGG1和hMTH1蛋白表達水平變化

Western blot結(jié)果見圖7，與陰性對照組比較，hOGG1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒和Cr6+染毒后表達水平分別升高47.6%、64.0%、47.0%，hMTH1蛋白在10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒以及Cr6+染毒后表達水平分別升高20.5%、49.8%、20.9%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖7 PM2.5染毒對HBE細胞hOGG1和hMTH1蛋白表達水平的影響

3 討論

本研究中，應(yīng)用單細胞凝膠電泳實驗檢測DNA損傷情況，表明PM2.5水溶液中劑量組20 μg/mL和高劑量組50 μg/mL對細胞DNA含量、尾長、尾距有明顯影響，與陰性對照組比較顯著升高；進一步用10和50 μg/mL PM2.5水溶液染毒HBE細胞，檢測DNA損傷修復(fù)基因hOGG1、hMTH1的mRNA和蛋白表達量的變化，結(jié)果顯示10和50 μg/mL PM2.5水溶液均引起HBE細胞中hOGG1和hMTH1 mRNA和蛋白表達水平均顯著高于陰性對照組；差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。這些結(jié)果提示，PM2.5對人支氣管上皮細胞DNA具有明顯的損傷作用。

大量的流行病學(xué)研究表明，空氣污染對人體健康存在嚴重危害[9-10]。DNA作為機體的主要遺傳物質(zhì)，其穩(wěn)定性對機體的作用至關(guān)重要，PM2.5中的各種有害物質(zhì)進入循環(huán)系統(tǒng)后，在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA損傷，可導(dǎo)致DNA雙鏈斷鏈[11]?？僧a(chǎn)生不同程度的致畸、致癌、致突變遺傳毒性，增加罹患惡性腫瘤的風(fēng)險以及畸胎的發(fā)病率[12]。由于PM2.5通過人體呼吸首先進入肺部，對呼吸系統(tǒng)影響毋庸置疑，所以本文選取的人支氣管上皮細胞HBE，HBE是永生化人支氣管細胞系[13]，仍保持人支氣管上皮細胞及非致瘤性特征。

鳥嘌呤的氧化還原電位較低，因此最易受到ROS的攻擊形成8-氧鳥嘌呤(8-oxo G)及8-氧脫氧鳥苷三磷酸(8-oxo-d GTP)，8-oxo-dG是一種主要的DNA氧化損傷產(chǎn)物，可在DNA復(fù)制中通過G→T或A→C堿基顛換導(dǎo)致DNA誤讀。8-oxo-d GTP在復(fù)制過程中可插入到DNA鏈中與堿基反應(yīng)形成8-oxo G。如果未及時處理8-oxo G，就會在DNA復(fù)制過程中造成G：C→T：A顛倒突變。人8-氧鳥嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)及MutT同源酶即人8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(hMTH1)是機體內(nèi)修復(fù)8-oxo G的主要工具酶。hMTH1主要負責(zé)核苷酸池中8-OH-GTP的清除，hOGG1主要負責(zé)DNA中對8-oxo-dG的修復(fù)，防止G：C→T：A顛倒突變，其共同作用與DNA損傷修復(fù)關(guān)系密切，能有效地檢測并定量分析細胞中DNA單雙鏈缺口損傷的程度，所以本文選擇檢測這兩個基因的表達水平。單細胞凝膠電泳實驗是經(jīng)典的檢測DNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術(shù)[14]，通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可以測定單個細胞DNA損傷程度，從而確定受試物的作用劑量與DNA損傷效應(yīng)的關(guān)系。該方法檢測低濃度遺傳毒性具有高靈敏性，研究的細胞不需處于有絲分裂期，同時這種技術(shù)需要的細胞數(shù)較少[15]。

鑒于目前大氣污染與肺癌發(fā)病存在密切關(guān)系，為了深入研究環(huán)境污染物致癌的分子毒理學(xué)機制，本文采用PM2.5染毒HBE細胞，研究PM2.5對DNA損傷修復(fù)基因表達的影響，探討PM2.5對細胞DNA損傷作用，對于今后進一步研究環(huán)境污染物和霧霾的健康危害，具有一定的理論意義和實際應(yīng)用價值。