甲基化芯片檢測電離輻射誘導人外周血淋巴細胞DNA甲基化水平的變化

田雪蕾，封江彬，田 梅，劉青杰*

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，中國疾病預防控制中心輻射防護與核應急重點實驗室，北京 100088)

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因的表達發(fā)生了可遺傳的改變。表觀遺傳學的研究范圍包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和各種RNA介導的反應[1-2]。其中研究的最廣泛的是DNA甲基化。DNA甲基化主要發(fā)生在5'-CpG-3'雙核苷酸序列的胞嘧啶上。在人類基因組中，大約有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的?；蚪M中存在成簇的CpG稱之為CpG島，島內(nèi)的CpG幾乎不被甲基化或甲基化程度很低，而島外的CpG大多數(shù)是甲基化的。DNA甲基化對基因表達的調(diào)控有重要作用[1-3]。

研究發(fā)現(xiàn)電離輻射能夠造成DNA甲基化水平的改變。目前對電離輻射誘導DNA甲基化改變的研究主要集中在全基因組DNA低甲基化上。研究報道4、7及10 Gy X射線急性全身照射后8、24、48及72 h，C57BL/6 NJcl小鼠肝組織中出現(xiàn)全基因組DNA低甲基化，0.5～10 Gy γ射線急性照射后24、48及72 h后，體外培養(yǎng)的CHO K-1、HeLa S-3、C1300 N1E及V79A03細胞中基因組DNA 5-甲基胞嘧啶均明顯減少[4-6]。大劑量及低劑量電離輻射均可誘導全基因組DNA低甲基化[7-12]。盡管研究證明電離輻射可以影響基因組DNA甲基化水平，但目前的研究大都是在動物細胞、腫瘤細胞而不是正常人的細胞中，從全基因組水平上來考察電離輻射對DNA甲基化的影響。而針對具體基因其甲基化受電離輻射的影響是怎樣的，以及這些基因的分子功能，參與哪些生物學途徑還不十分清楚。

基于此，本研究利用Illumina 450K甲基化芯片檢測不同劑量(0.5、2.0 Gy)照射后人外周血淋巴細胞基因組DNA甲基化水平的變化，篩選甲基化水平發(fā)生顯著性變化的基因。眾所周知，電離輻射能夠引起染色體畸變，而這些畸變的產(chǎn)生可能是因為DNA修復受阻的結(jié)果，所以本研究的目的是要探索受電離輻射影響的甲基化水平差異基因中是否有與DNA修復，維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關的基因，為在其中尋找新型輻射損傷標志物奠定前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Tris-HCl粉末(貨號H5135)和蛋白酶K購于Sigma Aldrich公司，十二烷基磺酸鈉(SDS)粉末購于北京市東環(huán)聯(lián)合化工廠。氯化鈉(NaCl)粉末，無水乙醇及75%乙醇購于北京化工廠。乙二胺四乙酸(EDTA)粉末購于北京化學試劑公司。

1.2 細胞外照射

在知情同意的情況下抽取人外周血全血樣本3份，本研究經(jīng)中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所醫(yī)學倫理委員會審核批準(倫理審查號LLSC2015-001)。將全血樣本分為3組，室溫下分別受到劑量為0.5和2.0 Gy的Co60γ射線的照射，以未照射樣本為陰性對照組，劑量率為0.5 Gy/min。照射后將樣品置于37℃培養(yǎng)箱2 h，然后提取DNA。放射源由北京師范大學北京輻射中心提供，源放射性活度為22.2 TBq，均勻照射野為25 cm×25 cm，樣品距放射源距離為126 cm。

1.3 人外周血淋巴細胞全DNA提取

取EDTA-Na2抗凝血5 mL，置于50 mL有蓋離心管中；加入5～8倍體積冷蒸餾水，反復顛倒混勻，冰中放置5 min后于4℃、4 000 r/min離心20 min；緩慢傾倒上清，在沉淀中加入4℃預冷0.9%NaCl(體積同上一步)，輕柔混勻沉淀，4℃、4 000 r/min離心20 min，棄上清；沉淀中加入2 mL裂解液，徹底打碎沉淀，加入10%的SDS 100 μL，混勻；加入10 mg/mL蛋白酶K(至終濃度為200 μg/mL)，混勻，55℃消化3 h；加入6 mol/L的NaCl 0.7 mL，劇烈震蕩20 s后5 000 r/min，離心20 min，將上清移至另一有蓋離心管中；加入2倍體積無水乙醇，反復顛倒混勻至出現(xiàn)絮狀DNA沉淀，挑出DNA至另一離心管中；75%乙醇洗滌DNA 2遍，將DNA放置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 IIIumina 450K甲基化芯片實驗

進行芯片實驗時每份樣本每個劑量點設置3個平行樣本。掃描原始數(shù)據(jù)，獲得每個位點原始信號值，然后依次進行熒光偏倚矯正、quantile歸一化；對于探針類型偏椅，對前一步校正后的甲基化水平進行校正。甲基化芯片實驗委托北京博奧晶典生物技術有限公司進行[13-15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對于甲基化水平差異分析，基于校正后的甲基化水平，采用empirical Baye statistics進行差異甲基化分析，同時針對多重假設檢驗問題，計算誤判率校正的P值(P校正)，選取P校正≤0.05的點為差異位點；對得到的差異位點分布情況進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計位點映射的甲基化水平差異基因，將甲基化水平差異基因進行GO功能富集分析，富集的標準為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲基化水平差異位點的數(shù)量及分布

本實驗一共掃描了473 760個位點，排除X、Y染色體上的位點。甲基化水平差異位點的數(shù)量如圖1所示。圖1A中，0.5 Gy γ射線照射組與陰性對照組相比，甲基化水平升高的位點有21 051個，甲基化水平降低的位點有9 075個。2.0 Gy γ射線照射組與陰性對照組相比，甲基化水平升高的位點有14 850個，甲基化水平降低的位點有9 284個。可以看出，隨著照射劑量的升高，甲基化水平升高的位點數(shù)量在減少，降低的位點數(shù)量有所增加。圖1B中，2.0 Gy照射組與0.5 Gy照射組相比，甲基化水平升高的位點有12 571個，甲基化水平降低的位點有13 884個。甲基化水平降低的位點數(shù)目多于甲基化水平升高的位點數(shù)目。

圖1 照射組與對照組相比甲基化水平差異位點數(shù)量變化

甲基化水平差異位點分布如圖2所示。分布區(qū)域的劃分是按與CG島的距離命名的?！癘pen sea”是指距離CG島兩端4 kb以外的區(qū)域，“shelf”是指距離CG島兩邊2～4 kb的區(qū)域，“shore”是指距離CG島兩邊0～2 kb的區(qū)域。從圖中可以看出，無論是0.5 Gy γ射線照射組還是2.0 Gy γ射線照射組，差異位點主要分布在“Open sea”，約占43%。當劑量升高時，分布在CPG島中的差異位點數(shù)量減少，而在“shore”區(qū)域的差異位點數(shù)量增多。

圖2 照射組與對照組相比甲基化水平差異位點分布變化

2.2 甲基化水平差異基因的數(shù)量

得到差異位點后，我們對各位點映射的基因情況進行了統(tǒng)計，計算出了甲基化水平差異基因的數(shù)量，如圖3所示。圖3A中，0.5 Gy γ射線照射組與陰性對照組相比，甲基化水平升高的基因有8 995個，甲基化水平降低的基因有4 826個。2.0 Gy γ射線照射組與陰性對照組相比，甲基化水平升高的基因有7 884個，甲基化水平降低的基因有5 555個?？梢钥闯?，隨著照射劑量的升高，甲基化水平升高的差異基因數(shù)量減少而降低的差異基因數(shù)量增加。對于同時在0.5 Gy和2.0 Gy兩個劑量點下甲基化水平均有差異的基因，水平升高的基因數(shù)目(1 311個)明顯大于甲基化水平下降的基因數(shù)目(286個)(圖3B)。

圖3 照射組與對照組相比甲基化水平差異基因數(shù)量變化

2.3 GO功能富集分析

DNA甲基化受許多細胞內(nèi)途徑的影響，但都涉及哪些途徑和功能還不十分清楚，快速有效的基因注釋對進一步識別基因，研究基因的表達調(diào)控機制，分析基因產(chǎn)物的相互作用關系具有重要意義，因此有必要描繪甲基化水平差異基因顯著富集在哪些功能。為了尋找不同樣品間差異基因可能和哪些基因功能的改變有關，我們用統(tǒng)計學方法對0.5和2.0 Gy γ射線照射下甲基化水平均有差異的基因進行了GO功能富集分析。如圖4所示，富集在3個水平上進行：生物途徑、細胞定位和分子功能。斜線表示背景基因分類到注釋中的數(shù)量，實色表示差異基因分類到注釋中的數(shù)量。根據(jù)分類到各個注釋中差異基因與背景基因的比例，GO功能在生物途徑上排在首位的是“細胞過程”(富集度=5.86)，在細胞定位上排在首位的是“細胞”(富集度=7.48)，在分子功能上排在首位的是“結(jié)合”(富集度=5.27)，說明分類到這3個注釋中的基因其甲基化對電離輻射是比較敏感的。

圖4 0.5和2.0 Gy γ射線照射下甲基化水平均有差異的基因GO 功能富集分析

通常人們更關心基因產(chǎn)物參與的生物學途徑和分子功能，因此將注釋到“細胞過程”和“結(jié)合”的基因進行了進一步細分。表1中列出了P＜0.05的情況下，富集度從大到小排前10名的注釋。

從表中可以看出，甲基化水平差異基因具有與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用相關的功能，如基因表達(GO：0010467)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA(GO：0044212)、結(jié)合核酸轉(zhuǎn)錄因子活性(GO：0001071)和RNA結(jié)合(GO：0003723)這樣的注釋被排在了前列。

除了參與調(diào)控基因表達外，DNA甲基化還對DNA修復、改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)和維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用。我們在核苷酸結(jié)合(GO：0001882)中初步篩選了一些基因。RAD54L，編碼產(chǎn)物為DEAD樣螺旋酶超家族，參與DNA雙鏈斷裂的同源重組修復；SMC1B，編碼產(chǎn)物為染色質(zhì)粘連蛋白家族成員，參與有絲分裂過程的DNA重組；INIP，編碼產(chǎn)物為DNA單鏈結(jié)合復合體亞基，對維持基因組穩(wěn)定起重要作用；HIST1H4K，編碼產(chǎn)物為組蛋白H4家族成員，對維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用。芯片結(jié)果顯示這些基因的甲基化水平隨照射劑量或顯著上升，或顯著下降。但能否作為輻射損傷標志物還需進一步研究。

表1 “細胞過程”及“結(jié)合”二級分類下按富集度大小排名前10的注釋

3 討論

本研究首次利用Illumina 450K甲基化芯片測定了在60Co γ射線照射下正常人外周血淋巴細胞DNA甲基化的變化。篩選了受電離輻射后的甲基化水平上調(diào)的基因有1 311個，甲基化水平下調(diào)的基因有286個。將這些甲基化水平差異基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示在生物途徑、細胞定位和分子功能3個水平排在首位的分別是“細胞過程”(富集度=5.86)，“細胞”(富集度=7.48)和“結(jié)合”(富集度=5.27)。同時在核苷酸結(jié)合(GO：0001882)中篩選出與DNA修復、維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關的基因，RAD54L、SMC1B、INIP和HIST1H4K，為尋找新型輻射損傷標志物奠定前期研究基礎。

以往的研究認為DNA甲基化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達[2，16-18]。本研究的芯片結(jié)果也顯示，甲基化水平差異基因顯著富集在基因表達(GO：0010467)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA(GO：0044212)、結(jié)合核酸轉(zhuǎn)錄因子活性(GO：0001071)和RNA結(jié)合(GO：0003723)。另外注釋到結(jié)合特異性序列雙鏈DNA的基因中，有多個編碼鋅指蛋白的基因。鋅指蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對基因表達起重要的調(diào)控作用[19-20]。顯著富集的甲基化水平差異基因大部分是甲基化水平升高的基因。研究表明，高度甲基化的序列往往被包裝在異染色質(zhì)中，而低度甲基化或非甲基化的序列則處在轉(zhuǎn)錄活躍的低凝聚態(tài)的染色質(zhì)中。因此基因的甲基化水平升高會降低其轉(zhuǎn)錄活性，影響編碼產(chǎn)物的生成。所以當輻射劑量升高時，細胞產(chǎn)生更多的損傷，這可能與相關基因甲基化水平改變，影響基因表達進而影響DNA損傷應答或修復有關。

作為良好的輻射損傷標志物，其水平受輻射劑量影響的趨勢要有一致性。盡管大多數(shù)報道認為電離輻射可以引起全基因組DNA的低甲基化。但有研究得出全基因組DNA甲基化水平隨輻射劑量的升高而升高的結(jié)果[21]。另有研究認為全基因組DNA甲基化水平隨輻射劑量呈先升高后下降或先下降后升高的趨勢[22]。還有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平隨電離輻射的變化具有組織特異性，其水平變化在不同組織可能呈現(xiàn)相反的趨勢[11，23]。因此，將DNA總甲基化水平作為輻射損傷標志物可能是不合適的。所以有必要篩選具體的甲基化水平差異基因。

電離輻射誘導細胞產(chǎn)生染色體畸變、微核和核質(zhì)橋等細胞遺傳學改變，其中染色體畸變和微核早已用于輻射生物劑量估算。細胞之所以產(chǎn)生這些異常可能是因為電離輻射導致DNA修復受阻或產(chǎn)生錯誤修復，進一步可能是因為與修復相關或染色體結(jié)構(gòu)維持相關基因的甲基化水平發(fā)生改變。因此在涉及DNA修復、維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等途徑的基因中尋找輻射損傷標志物更具有針對性。本研究初步篩選出的甲基化水平差異基因RAD54L、SMC1B、INIP和HIST1H4K能否成為新型輻射損傷標志物還需進一步研究。

綜上所述，本研究利用Illumina 450K甲基化芯片篩選出正常人外周血淋巴細胞甲基化水平差異基因，可進一步研究與DNA修復、維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關的基因甲基化水平作為輻射損傷標志物的可行性。