巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵產(chǎn)物對魔芋軟腐病菌的抑菌機(jī)制

趙妗頤，肖 洋，楊 龍，張 素，吉玉玉，李 祝,*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550003）

魔芋（Amorphophallus konjacK. Koch）又名蒟蒻、鬼芋等，隸屬天南星科魔芋屬，為多年生草本植物[1]，為我國西南地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物。魔芋球莖中含有葡甘聚糖、淀粉、粗纖維和各種氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[2-3]，其加工產(chǎn)物魔芋膠、魔芋粉等已被廣泛用作天然、健康、安全的食品原料[4]。但魔芋球莖水分含量高，易破損、腐爛、病變，在保藏期間對濕度、溫度的要求高，容易受到病原菌的侵染[5]，其中胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovorasubsp.carotovora）引起的細(xì)菌性病害——魔芋軟腐病是導(dǎo)致貯藏期魔芋腐爛變質(zhì)的主要原因之一，病菌可從傷口侵入魔芋體內(nèi)[6-7]。而目前貯藏期魔芋軟腐病主要依靠農(nóng)用鏈霉素來防治[8]，但隨著人類對食品安全問題的日益重視，化學(xué)防治方式被在采后農(nóng)產(chǎn)品上的應(yīng)用嚴(yán)格限制，因此尋求更加安全的采后農(nóng)產(chǎn)品病害防治方法對控制魔芋貯藏期軟腐病具有十分重要的意義。

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）作為食品工業(yè)技術(shù)中非常重要的微生物，在控制水稻紋枯病、番茄灰霉病、花生貯藏期中的黃曲霉等病害防治中得到廣泛應(yīng)用[9-11]，并且其產(chǎn)生的谷氨酸脫羧酶可催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸[12]，該氨基酸作為哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)傳遞素，具有降低血壓、鎮(zhèn)靜、利尿等功能[13-14]。

本研究通過常壓硅膠柱層析得到巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物各流分，經(jīng)檢測，流分LE4-3對貯藏期魔芋軟腐病原菌——胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1（以下簡稱EC-1）有良好抑制作用，并經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析其成分，再對其抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，著重考察該活性流分對EC-1細(xì)胞膜通透性、大分子物質(zhì)核酸和蛋白含量變化、可溶性總糖質(zhì)量濃度、菌體總蛋白、菌體磷代謝和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平變化的影響，旨在為貯藏期魔芋軟腐病的控制提供一定的應(yīng)用理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）L2（CCTCC No. M2012381）由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。EC-1由貴州大學(xué)微生物所分離、鑒定并保存。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL；發(fā)酵液體培養(yǎng)基：蛋白胨25 g、牛肉膏4.58 g、氯化鈉3.21 g、葡萄糖15 g、蒸餾水1 000 mL。

ROS檢測試劑盒 上海碧云天公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DDB303A電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器廠；CAMX PLUS酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；BIOMATE 3S紫外分光光度計 美國Thermo Fisher公司；JY300HE電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；7890A/5975C型GC-MS儀 美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取及分析

1.3.1.1 巨大芽孢桿菌菌粉的制備

巨大芽孢桿菌L2種子液的制備：接種一環(huán)巨大芽孢桿菌L2于裝有100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，使其OD600nm為0.6～0.8。

將上述巨大芽孢桿菌L2種子液按體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接種于裝有80 L發(fā)酵液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在30 ℃、150 r/min、通氣量為1.5 L/min的條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥制成菌粉備用。

1.3.1.2 巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取及常壓硅膠柱層析分離

取500 g菌粉加入1.5 L工業(yè)乙醇于60～100 ℃回流提取4 h，重復(fù)3 次得巨大芽孢桿菌粗提液，將該粗提液減壓濃縮后加水溶解，再通過乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮后得到的浸膏（19.23 g）與40～80 目硅膠拌樣，揮干溶劑上樣，在硅膠層析柱上進(jìn)行常壓硅膠柱層析。分別用石油醚-乙酸乙酯（100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1，V/V）、乙酸乙酯-甲醇（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶0，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度柱層析體系為10 L，分段收集洗脫液。通過薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC）結(jié)果及Rf值判斷，體積分?jǐn)?shù)5%的濃硫酸-乙醇溶液和0.8 g/100 mL磷鉬酸-乙醇溶液顯色綜合分析，將相同主點流分合并得17 個段：LE1～LE17。TLC展開體系選取石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V），展開3 次，主點Rf值為0.3的流分LE4（2.721 7 g）繼續(xù)進(jìn)行常壓硅膠柱層析。分別用石油醚-乙酸乙酯（80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，V/V）、甲醇進(jìn)行洗脫，并通過TLC及顯色分析將LE4流分沖柱合并得7 個段：LE4-1～LE4-7，分段收集洗脫液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.1.3 LE4-1～LE4-7對EC-1抑菌作用的測定

LE4-1～LE4-7用二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制成200 mg/mL的母液備用。分別在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入EC-1種子液（OD600nm為0.6～0.8），再分別加入LE4-1～LE4-7母液，使其終質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL，并以無菌水為空白對照、氯霉素為藥物對照、DMSO為溶劑對照，30 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后于490 nm波長處測定吸光度，并按下式計算抑菌率。

1.3.1.4 LE4-3的GC-MS分析

脂肪酸甲酯化：稱取50 mg LE4-3，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)1%的硫酸-甲醇溶液，超聲振蕩10 min后置于70 ℃水浴30 min取出，加入2 mL正己烷，振蕩5 min后取上清液加入0.5～1.0 g無水硫酸鈉及5 mL飽和NaCl溶液，振蕩1 min，靜置5 min，取上層溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，備用。

GC-MS條件：取LE4-3直接進(jìn)樣1 μL，色譜柱為AB-INOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm）；初始溫度50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃后，保持15 min，運(yùn)行時間55 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（純度99.999%）；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間5.0 min。離子源為電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 624 V，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.3.2 LE4-3的抑菌機(jī)制分析

1.3.2.1 LE4-3 IC50的測定

按1.3.1.3節(jié)方法測定LE4-3與氯霉素的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。LE4-3終質(zhì)量濃度設(shè)置為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL，氯霉素為0.06、0.08、0.1、0.2、0.4 mg/mL，并用SPSS Statistics 19.0軟件分別計算兩者的IC50。

1.3.2.2 菌液電導(dǎo)率的測定

根據(jù)宋麗雅等[15]的方法，將菌懸液（OD600nm為0.6～0.8）按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，并加入LE4-3母液使其終質(zhì)量濃度為IC50，于30 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、10、20、30、40、50、60 min時，各取5 mL培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心5 min后取上清液測其電導(dǎo)率。以無菌水為空白對照，氯霉素為藥物對照，每組設(shè)3 個平行，下同。

1.3.2.3 核酸蛋白質(zhì)泄漏的測定

根據(jù)劉國榮等[16]的方法，并按1.3.2.2節(jié)方法處理樣品，在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h時，各取3 mL培養(yǎng)液，經(jīng)4 500 r/min離心5 min后取上清液分別在260 nm和280 nm波長處測定光密度值。

1.3.2.4 可溶性總糖質(zhì)量濃度的測定

葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考文獻(xiàn)[17]：精確量取1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于不同試管中，分別加入蒸餾水至總體積為1.0 mL，搖勻后取50 μL加入200 μL蒽酮試劑，冰浴5 min，沸水浴10 min，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀于630 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝3.906 0x＋0.056 9，決定系數(shù)R2＝0.999 1，具有良好線性關(guān)系，滿足樣品測試要求。

可溶性總糖質(zhì)量濃度的測定采用蒽酮比色法。根據(jù)錢麗紅等[18]的方法，并按1.3.2.2節(jié)方法處理樣本，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h時，各取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min后取50 μL上清液，按上述方法操作，用酶標(biāo)儀于630 nm波長處測定吸光度。將所測吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算可溶性總糖質(zhì)量濃度。

1.3.2.5 SDS-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照吳海霞[19]的方法并作改動：按1.3.2.2節(jié)方法處理樣品，分別在培養(yǎng)0、4、8、12 h時取菌懸液1 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，無菌水洗滌沉淀2 次，加入40 μL 2×上樣緩沖液，沸水浴10 min，離心取上清液。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，電極緩沖液為5×Tris-甘氨酸，上樣量10 μL，電壓85 V，電流100 mA，時間1.5～2.0 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%考馬斯亮藍(lán)R-250染液過夜染色，脫色液為乙醇-醋酸-水溶液（10∶5∶85，V/V），脫色完成后使用凝膠成像儀拍照并分析。

1.3.2.6 LE4-3對EC-1菌體磷代謝的影響

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確量取500 μg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于不同試管，分別加入蒸餾水至總體積為1.0 mL，搖勻取0.1 mL加入1 mL三氯乙酸-硫酸亞鐵溶液反應(yīng)10 min，4 000 r/min離心5 min，取0.2 mL上清液加50 μL鉬酸銨溶液，混勻，30 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀于630 nm波長處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），以吸光度為縱坐標(biāo)，得到磷質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.003 7x＋0.069 3，決定系數(shù)R2＝0.995 6，具有良好線性關(guān)系，滿足樣品測試要求。

菌體磷質(zhì)量濃度的測定參考翟培等[20]的方法并作改動。將EC-1菌懸液4 000 r/min離心5 min棄上清液，無菌水洗滌菌體2 次，并稀釋菌體至OD600nm為0.5。取0.5 mL稀釋菌液于試管中，按體積比1∶1加入1.0 mg/mL葡萄糖溶液，搖勻加入200 μL 500 μg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入LE4-3母液使其終質(zhì)量濃度為IC50，依次培養(yǎng)至0、2、4、6、8、10、12 h時，取0.1 mL菌懸液按上述方法進(jìn)行測定，并用酶標(biāo)儀于630 nm波長處測定吸光度。將所測吸光度代入磷質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算磷質(zhì)量濃度。

1.3.2.7 ROS水平的測定

嚴(yán)格按照ROS檢測試劑盒說明書檢測LE4-3處理菌體內(nèi)ROS水平，以無菌水為空白對照，Rosup為陽性對照，每組設(shè)3 個平行。以2’,7’-二氯熒光素的熒光強(qiáng)度表示菌體細(xì)胞內(nèi)ROS水平，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明ROS水平越高。采用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Image J 17.0軟件對熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，所有實驗設(shè)3 個平行，結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LE4-1～LE4-7對EC-1的抑制作用

圖 1 流分LE4-1～LE4-7對EC-1的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of the fraction LE4-1-LE4-7 on action on EC-1

由圖1可知，流分LE4-3、LE4-4、LE4-5對EC-1的抑菌效果較好，其中LE4-3的抑菌率最高，為（79.40±0.47）%，且與LE4-4、LE4-5差異顯著（P＜0.05）。藥物對照氯霉素的抑菌率為（89.20±0.99）%，溶劑對照DMSO抑菌率為（5.92±0.12）%，即該溶劑對EC-1影響較小，可作為配制LE4-1～LE4-7母液的溶劑。

2.2 LE4-3的GC-MS分析結(jié)果

LE4-3的總離子流圖及GC-MS檢測結(jié)果見圖2及表1。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對NIST2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了LE4-3的化學(xué)成分，用峰面積歸一化法計算各化學(xué)成分的相對含量。由表1可知，LE4-3共檢測到34 種化合物，鑒定出其中21 種成分，主要物質(zhì)為苯乙酸乙酯（相對含量32.190%）、亞油酸（相對含量15.819%）、苯乙酸甲酯（相對含量13.793%）、硬脂酸乙酯（相對含量9.105%）。

圖 2 流分LE4-3的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of fraction LE4-3

表 1 流分LE4-3的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of fraction LE4-3

近年來研究者對脂肪酸及其衍生物如脂肪酸甲酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪醇、磺化脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等的抑菌作用十分關(guān)注，該類物質(zhì)已被美國食品及藥品管理局認(rèn)證為一般公認(rèn)安全的食品添加劑[21-22]。Kelsey[23]與Sun[24]等報道了脂肪酸及其衍生物對金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌有良好的抑制作用；王君等[25]從黃粉蟲成蟲體內(nèi)提取的脂類抗菌物質(zhì)對蘋果炭疽病害和梨黑星病害有明顯的抑制作用。此外，據(jù)俞發(fā)榮等[26]報道，十八烯酸對人腎癌細(xì)胞A498細(xì)胞具有毒性作用；Yamazakti等[27]報道棕櫚酸的甘油單酯對李斯特菌有一定的抑制作用。因此具有抑菌作用的脂肪酸及其衍生物可以作為安全高效的天然防腐劑應(yīng)用于食品。

2.3 LE4-3的抑菌機(jī)制分析結(jié)果

2.3.1 LE4-3的IC50測定結(jié)果

圖 3 LE4-3對EC-1的IC50Fig. 3 IC50 of chloramphenicol and fraction LE4-3 against EC-1

由圖3可知，LE4-3質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時抑菌率可達(dá)（78.60±0.94）%，與1.4 mg/mL時的抑菌率差異不顯著（P＞0.05）；而氯霉素在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時抑菌率已達(dá)（81.60±0.45）%。LE4-3與氯霉素的IC50分別為（1.06±0.01）、（0.08±0.00）mg/mL，選擇IC50進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3.2 LE4-3對菌液電導(dǎo)率影響

細(xì)胞膜作為細(xì)菌的保護(hù)屏障，當(dāng)細(xì)菌受到藥物毒害或處于不利環(huán)境時細(xì)胞膜完整性被破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升[28-29]。由圖4可知，LE4-3作用EC-1菌體初期，上清液電導(dǎo)率與作用時間呈正相關(guān)，且氯霉素與LE4-3組始終高于空白組，當(dāng)作用60 min時，LE4-3組的電導(dǎo)率相比空白組與氯霉素組分別增加了8.98%、4.90%（P＜0.05），推測LE4-3能改變EC-1菌體細(xì)胞膜通透性，使菌體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的外泄到培養(yǎng)液中。

圖 4 流分LE4-3對EC-1培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effect of fraction LE4-3 on extracellular conductivity of EC-1

2.3.3 LE4-3對菌體核酸、蛋白質(zhì)泄漏的影響

圖 5 LE4-3對EC-1核酸、蛋白質(zhì)泄漏的影響Fig. 5 Effect of fraction LE4-3 on nucleic acid and protein leakage of EC-1

培養(yǎng)液OD260nm和OD280nm可反映菌體細(xì)胞DNA與RNA的泄漏情況，從而推測菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[30]。由圖5可知：隨著培養(yǎng)時間的延長，氯霉素組的核酸和蛋白含量基本與空白組持平，但LE4-3作用菌體后培養(yǎng)液中核酸、蛋白質(zhì)的含量均高于空白組與氯霉素組；在培養(yǎng)12 h時，LE4-3組OD260nm和OD280nm分別為0.046 7±0.001 1和0.081 3±0.001 5，明顯高于空白組（32.1%、23.9%）和氯霉素組（62.6%、23.9%），因此推測LE4-3破壞了EC-1細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白外泄。

2.3.4 LE4-3對菌液可溶性總糖質(zhì)量濃度的影響

糖類是微生物重要的能源和碳源。在正常條件下微生物能主動從環(huán)境中攝取所需營養(yǎng)物質(zhì)，而當(dāng)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括糖類發(fā)生泄漏，所以可通過測定細(xì)菌培養(yǎng)液中可溶性總糖質(zhì)量濃度變化檢測細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)完整性[31]。由圖6可知，LE4-3處理EC-1后胞外溶液可溶性總糖質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，培養(yǎng)12 h時達(dá)到（0.502±0.039）mg/mL，為空白組的340%，說明LE4-3在增加EC-1細(xì)胞膜通透性同時也破壞了其細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致大分子糖類物質(zhì)泄漏到胞外，而空白組中可溶性總糖質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)，說明菌體細(xì)胞膜保持完整，并能吸收菌體外糖類物質(zhì)供自身利用。

圖 6 LE4-3對EC-1菌液可溶性總糖質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effect of fraction LE4-3 on soluble total sugar concentration of EC-1

2.3.5 LE4-3對菌體蛋白表達(dá)的影響

圖 7 LE4-3處理后EC-1菌體總蛋白的SDS-PAGE圖譜 Fig. 7 SDS-PAGE of total bacterial proteins from EC-1 treated with fraction LE4-3

SDS-PAGE可測定未知蛋白分子質(zhì)量大小[32]，也可通過SDS-PAGE圖譜反映蛋白質(zhì)含量的變化[33]。由圖7可知，當(dāng)氯霉素處理4、8、12 h時，菌體總蛋白含量明顯低于空白組。氯霉素能與核糖體50S亞基相結(jié)合，進(jìn)而特異性的阻止mRNA與核糖體結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成[34-35]。而LE4-3處理4、8、12 h時，菌體總蛋白含量同樣低于空白組，則說明LE4-3處理也可阻礙EC-1菌體蛋白合成，起到抑制作用。

2.3.6 LE4-3對菌體磷代謝的影響

磷是所有生物必需的微量元素，是核酸、磷脂及糖代謝中間產(chǎn)物的重要組成成分，在細(xì)胞能量代謝中起核心作用，細(xì)菌可利用葡萄糖經(jīng)一系列磷酸化反應(yīng)，為生長繁殖提供所需能量，因此通過檢測細(xì)菌代謝活動中磷消耗狀況可反映出細(xì)胞整體代謝功能和生長狀態(tài)[36]。

由圖8可知，空白組磷質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)，說明菌體在生長過程中消耗培養(yǎng)體系中的磷進(jìn)行正常的代謝活動，而經(jīng)LE4-3和氯霉素處理后菌體磷代謝受到嚴(yán)重影響，在培養(yǎng)2 h后磷代謝緩慢，且磷質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)但與空白組差異明顯，表明LE4-3與氯霉素可影響EC-1細(xì)胞磷代謝，因此推測EC-1菌體細(xì)胞經(jīng)LE4-3處理后磷代謝能力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝受阻。

圖 8 LE4-3對EC-1磷代謝含量的影響Fig. 8 Changes in phosphorous metabolism in EC-1 treated with fraction LE4-3

2.3.7 LE4-3對ROS水平的影響

圖 9 LE4-3對EC-1內(nèi)ROS水平的熒光定量分析Fig. 9 Fluorescent quantitative analysis of ROS level in EC-1 treated with fraction LE4-3

ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，是一類分子氧部分還原的分子或離子，過量的ROS能夠使DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子發(fā)生過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響生理活性，胞內(nèi)ROS過度積累，會對膜脂、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生氧化損傷，進(jìn)而觸發(fā)或者加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程[37-39]。由圖9可知，LE4-3可以刺激EC-1菌體產(chǎn)生較多ROS，LE4-3胞質(zhì)中ROS水平呈先升后降趨勢，在培養(yǎng)30 min時出現(xiàn)峰值，為空白組的338%，與其相比差異極顯著（P＜0.01），推斷LE4-3可造成EC-1細(xì)胞氧化損傷。

3 結(jié) 論

巨大芽孢桿菌L2流分LE4-3對魔芋軟腐病原菌EC-1具有良好抑制作用，其IC50為（1.06±0.01）mg/mL，經(jīng)GC-MS共檢測到34 種成分，鑒定出其中21 種已知化合物，其中苯乙酸乙酯、亞油酸乙酯、苯乙酸甲酯為相對含量最高的3 種物質(zhì)；并且推測LE4-3可通過影響細(xì)胞膜功能、損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及能量代謝等方面抑制EC-1生長，為開發(fā)魔芋貯藏期軟腐病天然防腐劑防治提供了理論依據(jù)。